Gewinnung von adeno-assoziierten Viren aus transfizierten Säugetierzellen

Zusammenfassung

Quelle: Rghei, A. D., et al. Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien an großen Tiermodellen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die Gewinnung eines rohen adeno-assoziierten Virus aus transfizierten Säugerzellen mittels chemischer Lyse und Zentrifugation, wodurch eine AAV-Produktion mit hoher Ausbeute für nachgeschaltete Reinigungsverfahren und präklinische Gentherapie-Anwendungen ermöglicht wird.

Protokoll

1. Gewinnung von AAV (adeno-assoziiertem Virus) und chemische Lyse der transfizierten HEK293-Zellen (human embryonale Niere 293)

1. Schütteln Sie die Zellkulturkammer kräftig, um die Zellen zu lösen, bis das Medium trüb erscheint, verursacht durch die gelösten Zellen, und gießen Sie die Suspension in vier Zentrifugenröhrchen mit je 500 mL Fassungsvermögen.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 min bei 18.000 × g und 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Gießen Sie den geklärten Überstand in eine 1-Liter-Polyethylenterephthalat-Copolyester-(PETG-)Flasche.HINWEIS: Falls kein Hochgeschwindigkeitszentrifugiergerät zur Verfügung steht, zentrifugieren Sie 40 min bei 12.000 × g. Bei dieser Geschwindigkeit ist das Zellpellet möglicherweise nicht fest und kann beim Abgießen des Überstandes verrutschen.
3. Resuspendieren Sie die Zellpellets in den 500-mL-Zentrifugenröhrchen mit jeweils 50 mL Lysepuffer und inkubieren Sie 60 min bei 37 °C.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut 30 min bei 18.000 × g, überführen Sie anschließend den Überstand in dieselbe 1-Liter-PETG-Flasche und entsorgen Sie das pelletierte Zelltrümmermaterial.HINWEIS: Reinigen Sie den geklärten Überstand unverzüglich und lagern Sie ihn bis zu 72 Stunden bei 4 °C. Für die Langzeitlagerung bewahren Sie ihn bei -80 °C auf. Lagern Sie nicht bei -20 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10-Kammer-Cellstack	Corning	3271
1-L-PETG-Flasche	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1000 mg/L D-Glucose, L-Glutamin	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Fetales Kälberserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293-Zellen	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Unmittelbar nach Erhalt die Zellen auftauen und gemäß Herstellerprotokoll kultivieren. Sobald die Zellen minimal weitergepflanzt wurden und gut wachsen, einen Teilabschnitt in Aliquots einfrieren und in flüssigem Stickstoff lagern. Verwenden Sie stets Zellen mit einem Passage-Nummer unter 30. Wenn kultivierte Zellen mehr als 30-mal weitergepflanzt wurden, wird empfohlen, eine Kultur aus den gelagerten Aliquots neu zu starten
Stützkissen für Zentrifugenröhrchen mit großem Volumen	Corning	CLS431124	Das Stützkissen muss mit Zentrifugenröhrchen mit großem Volumen verwendet werden, es sei denn, der Zentrifugenrotor verfügt über geeignete V-Boden-Kissen
Zentrifugenröhrchen mit großem Volumen	Corning	CLS431123-6EA	500-mL-Zentrifugenröhrchen