Lentiviral-Vektor-basierte Transduktion von befruchteten Rattenembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Koza, P., et al. Erzeugung transgener Ratten mittels eines lentiviralen Vektoransatzes. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die mikroinjektionsgestützte Applikation von lentiviralen Vektoren in befruchtete Rattenembryonen zur Erzielung stabiler Transgenintegration für die Erzeugung transgener Ratten.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Proben beinhalten, wurden von dem zuständigen Tierversuchsethikrat geprüft und genehmigt.

1. Mikroinjektion von Lentiviren-Vektoren in Embryonen im Ein-Zell-Stadium unter die Zona pellucida
   HINWEIS: Verwenden Sie Ein-Zell-Stadium-Embryonen mit zwei sichtbaren Pronukleus für die Mikroinjektion (Abbildung 1).
   1. Tauen Sie die Lentivirus-(LV-)Aliquote bei Raumtemperatur auf und zentrifugieren Sie sie 2 min bei 10.000 x g und Raumtemperatur (RT), um verbleibende zelluläre Trümmer zu pelletieren.
   2. Mikroinjektionsaufbau
      1. Bereiten Sie Glas-Haltepipetten (Borosilikat-Glaskapillare) mithilfe eines Mikroschweißgeräts vor. Ziehen Sie die Glaskapillare über einer Flamme, um eine Spitze von 5–10 cm Länge zu erzeugen. Brechen Sie die Pipette so, dass eine Spitze von etwa 4 cm verbleibt. Der Außendurchmesser sollte etwa 80–120 µm.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze vollständig gerade und glatt ist.
      2. Bauen Sie die gezogene Pipette in einer Mikroschweißvorrichtung so zusammen, dass die Spitze vor dem Heizfilament steht. Heizen Sie das Filament unmittelbar nahe der Pipettenspitze und lassen Sie diese auf einen Durchmesser von ca. ~15 µm (ca. 20 % der Embryogröße). Positionieren Sie die Pipette senkrecht zum Heizfaden, 2–3 mm von der Pipettenspitze entfernt, und beginnen Sie das Erhitzen. Das Glas wird weich. Erhitzen Sie, bis ein Winkel von 15° erreicht ist. 15° Winkel
      3. Bereiten Sie Mikroinjektions-Kapillaren aus borosilikatem Glas mit einem Filament mithilfe eines Kapillarpullers vor. Setzen Sie die Kapillare in die Zugkammer ein. Führen Sie einen Rampentest durch (erstmalig bei neuem Glas und jedes Mal nach dem Wechsel des Filaments). Stellen Sie die Wärme auf den Rampenwert minus 10, Zug auf 100, Geschwindigkeit auf 150 und Zeit auf 100 ein.
         HINWEIS: Passen Sie die Parameter an, um eine optimale Injektionskapillare zu erhalten.
      4. Unter einem biosicheren Flusswerkhafte, füllen Sie etwa 2 µL der viralen Lösung in die Mikroinjektionspipette mit einer Mikrolader-Spitze.
      5. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsschale (Deckel einer 60-mm-Petri-Schale) mit einer 100 µL Tropfen M2-Medium (in der Mitte), bedeckt mit flüssigem Paraffin oder Mineralöl.
      6. Montieren Sie die Haltespitze und die mit viraler Lösung beladene Mikroinjektionskapillare an einen Mikromanipulator und die Mikroinjektionsschale unter einem inversen Mikroskop.
   3. Durchführung der Mikroinjektion
      1. Transferieren Sie 15–20 Ein-Zell-Embryonen in den M2-Tropfen auf der Mikroinjektionsplatte. Halten Sie den Embryo mit einer Haltepipette.
      2. Unter Verwendung einer 400fachen Vergrößerung wird die LV-Lösung mit der Glas-Kapillare, die mit einem automatischen Injektor verbunden ist, unter die Zona pellucida in den perivitellinen Raum injiziert. Die Kapillare kurz unter der Zona pellucida halten.
         HINWEIS: Unter Verwendung eines sanften positiven Drucks fließt die virale Lösung kontinuierlich aus der Injektionskapillare aus, jedoch kann das applizierte Volumen der Suspension nicht kontrolliert werden.
      3. Mit einer feinen Pipette werden die Embryonen in die Kulturschale im Inkubator bei 37 °C in einer 5 % CO₂-Atmosphäre₂ Atmosphäre. Die Anzahl der Injektionen eines Zygots kann variieren und je nach Konzentration des viralen Vektors angepasst werden.
         HINWEIS: Die injizierten Embryonen können im Ein-Zell-Stadium in Pflegemütter transferiert oder über Nacht in M16-Medium inkubiert und anschließend im Zwei-Zell-Stadium transferiert werden. Eine verlängerte In-vitro-Kultur von Rattenembryonen sollte vermieden werden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Mikroskopische Aufnahme eines Ein-Zell-Stadiums-Rattenembryos, der für die subzonale Injektion eines lentiviralen Vektors vorbereitet wurde. Der Embryo wurde mit einer Haltepipette fixiert. Zwei Pronuklei, die das mütterliche und väterliche genetische Material enthalten, sowie der Polkörper sind sichtbar. Maßstab = 20 μm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aspiratorrohrbausätze für kalibrierte Mikrokapi­llarpipetten	Sigma	A5177-5EA
Borsilikatglas-Kapillaren mit Filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Injektionskapillare
CELLSTAR Zellkulturschale, 35 mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Zellkulturschale, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Mineralöl	Sigma	M8410-500ML
Invertiertes Mikroskop	Zeiss	Axiovert 200
M2-Medium	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Halterkapillare
M16-Medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D