Reinigung der viralen Integrase mittels Heparin-Affinitätschromatographie

Zusammenfassung

Quelle: Lopez Jr., M. et al. Nachweis und Entfernung von Nuklease-Kontaminationen während der Reinigung rekombinanter integrase des prototypischen Foamy-Virus. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video wird das Verfahren zur Reinigung viraler Integrases aus bakterieller Nukleasekontamination mithilfe der Heparin-Sepharose-Säulenchromatographie sowie die anschließende SDS-PAGE-Analyse zur Bestätigung der Proteinreinheit demonstriert.

Protokoll

1. Heparingelelektrophorese
   1. Stellen Sie 250 mL Puffer C (50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 500 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) und 250 mL Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl) her.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden das Schnell-Protein-Flüssigchromatographiesystem (FPLC), die Puffer und die Probe in einem Kühlschrank bei 4 ˚C aufbewahrt.
      1. Sterilfiltern Sie die Puffer C und D mit Einweg-Filtereinheiten mit einer Porengröße von 0,2 μm. Spülen Sie je nach FPLC-System die Pumpe A und die Pumpe B jeweils mit Puffer C und Puffer D. Leiten Sie 80 % Puffer C und 20 % Puffer D durch das System, bis die Leitfähigkeits- und Ultraviolett-(UV-)Messwerte stabil sind. Die maximale Flussrate hängt vom Gerät ab; üblicherweise verwenden wir eine Flussrate von 5 mL/min bei einer maximalen Druckbegrenzung von 1,0 MPa.
   2. Stellen Sie eine 80 mm lange, 5 mm durchmessende FPLC-Säule mit 1 mL Heparin-Sepharose-Harz her (maximale Bindungskapazität: 2,0 mg Rinder-Antithrombin III pro mL Harz; maximaler Druck 1,4 MPa). Die Säule kann am Tag vor der Reinigung vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. Schließen Sie die Säule an das FPLC-Gerät an.
      1. Äquilibrieren Sie die Säule mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl) bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und einer maximalen Druckbegrenzung von 1 MPa. Das Gerät sollte Echtzeitdaten zur Leitfähigkeit und zur UV-Absorption bei 280 nm (A₂₈₀) aufzeichnen. Die Leitfähigkeits- und UV-Messwerte sollten sich stabilisieren. Falls diese Messwerte nicht stabil sind, leiten Sie weiterhin Puffer durch die Säule, bis Stabilität erreicht ist.
   3. Senken Sie die NaCl-Konzentration der Probe des Prototyp-Foamy-Virus-Integrase (PFV IN) durch Zugabe von 1,5 Volumina Puffer C auf 200 mM. Zum Beispiel geben Sie 15 mL Puffer C zu 10 mL PFV IN. Unser Gesamtvolumen beträgt typischerweise ~25 mL.
   4. Tragen Sie die verdünnte PFV-IN-Probe auf die Heparin-Sepharose-Säule bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und einer maximalen Druckbegrenzung von 1,0 MPa auf. Die Flussrate und der Säulendruck bleiben während der gesamten Reinigung konstant. Sammeln Sie den Durchlauf in einem 50 mL-Kegelrohr.
      1. Spülen Sie die Säule mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl), wobei Sie den Waschdurchlauf in einem 50 mL-Kegelrohr auffangen. Eluieren Sie die Säule mit einem 30 mL linearen Gradienten von 20 % bis 100 % Puffer D (200 mM bis 1 M NaCl).
      2. Spülen Sie die Säule mit 5 mL 100 % Puffer D. Sammeln Sie den Elutionsgradienten und den abschließenden Waschdurchlauf in Fraktionen zu je 0,37 mL.
   5. Analysieren Sie die Auftrag, den Durchlauf, die Waschfraktion und die Elutionsfraktionen mittels 8 %iger Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). PFV IN weist nach Spaltung des Hexahistidin-Tags ein Molekulargewicht von 44.394 Da auf, und der Extinktionskoeffizient beträgt ohne das Hexahistidin-Tag weiterhin 59.360 cm^-1 M^-1. Lagern Sie alle Fraktionen bei 4 ˚C, bis ein Nuklease-Assay abgeschlossen ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)	Amresco	754
DTT (Dithiothreitol)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01