Quantifizierung von Pseudoviruspartikeln mittels Plaque-Assay

Zusammenfassung

Quelle: Jamieson, T. R., et al., Nachweis von SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpern mittels hochdurchsatzfähiger fluoreszenzbasierter Bildgebung der Pseudovirusinfektion. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video beschreibt den Virus-Plaque-Assay unter Verwendung von Pseudoviruspartikeln des Coronavirus. Das verdünnte Pseudovirus wird einer Zellschicht aus Säugetierzellen hinzugefügt und anschließend mit einer Methylcellulose-Abdeckung inkubiert. Die durch infizierte Zellen gebildeten Plaques werden visuell gezählt, um die infektiöse Virus-Titer zu bestimmen.

Protokoll

Titrierung des vesikulären Stomatitis-Virus, das das Spike-Protein des Coronavirus und das verbesserte grün fluoreszierende Protein (VSV-S-eGFP) exprimiert, Pseudovirus

1. Serie­lle Verdünnung zur Bestimmung der Virus­titration

1. Säen Sie Vero-E6-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6 × 10⁵ Zellen pro Well in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium oder DMEM (mit 10 % FBS (fötales Kälberserum)) und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂.

HINWEIS: Vero-Zellen, die TMPRSS2 und hACE2 überexprimieren, können ebenfalls verwendet werden.

2. Bereiten Sie eine zehnfache serielle Verdünnungsreihe des VSV-SeGFP-Virus in kaltem, serumfreiem DMEM vor, indem Sie 900 μL Medium in sieben Mikrozentrifugenröhrchen geben. Beschriften Sie die Röhrchen von 1 bis 7. Geben Sie 100 μL der Virusstammlösung in das erste Röhrchen und wirbeln Sie kurz um. Übertragen Sie 100 μL verdünntes Virus von Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und wirbeln Sie kurz um; setzen Sie den Vorgang bis Röhrchen 7 fort.

3. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen der 6-Loch-Platte mit Vero-E6-Zellen, und ersetzen Sie es durch 500 µL der Verdünnungen 10⁵ bis 10⁷. Inkubieren Sie die Platten 45 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO₂, wobei alle 15 Minuten vorsichtig geschüttelt wird.

4. Den Inokulum abpipettieren und durch eine Überlagerung ersetzen, die ein 1:1-Gemisch aus 2x DMEM und 6 % Carboxymethylcellulose (CMC), endgültige Konzentration 3 % CMC, ergänzt mit 10 % FBS, enthält; 48 h bei 34 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.

HINWEIS: Das Überzugsgemisch während des Infektionsschritts 15 min lang in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen. Anstelle von CMC kann ein 1:1-Gemisch aus 1 % Agarose und 2x DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, verwendet werden. Zum Überziehen mit Agarose 1 % Agarose (in dH₂O) aufkochen und mit kaltem 2x DMEM mischen. Sicherstellen, dass die Mischung eine geeignete Temperatur aufweist, bevor sie der Zellmonolayer hinzugefügt wird (ca. 37–40 °C). Falls Agarose als Überzug verwendet wird, müssen die Zellen durch Inkubation in 2 mL eines 3:1-Verhältnisses aus Methanol:Essigsäure mindestens eine Stunde vor der Färbung fixiert werden.

2. Färbung und Berechnung der Virus-Titer

1. Visualisieren Sie Plaques durch Färbung mit Kristallviolett oder durch direkte Visualisierung von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop.

2. Zum Färben der Platten: Überstand absaugen, einmal mit PBS waschen und dann 2 mL 0,1 % Kristallviolett (in 80 % Methanol und dH₂O) in jedes Well geben. Anschließend etwa 20 min bei Raumtemperatur auf einem Plattenrührer schwenken, bevor das Entfärben erfolgt. Das Kristallviolett entfernen und jedes Well vorsichtig zweimal mit dH₂O oder PBS waschen.

HINWEIS: Die Schritte zum Waschen und Färben sollten vorsichtig durch langsames Pipettieren an die Seite jedes Wells durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Verfahrens intakt bleibt.

3. Lassen Sie die Platten mindestens 1 h trocknen, bevor Sie die Plaques zählen. Stellen Sie sicher, dass die Plaque-Zählungen aus Wells stammen, die 20 bis 200 Plaques enthalten. Um die Titer des Virus in Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro mL zu berechnen, multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor des ausgewerteten Wells mit dem Infektionsvolumen und dividieren Sie die Anzahl der in dem jeweiligen Well vorhandenen Plaques durch dieses Produkt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco)	Fisher scientific	LS25200114
Vero-E6-Zellen	ATCC	CRL-1586
Carboxymethylcellulose	Sigma	C5678
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (Pulver) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
SARS-CoV-2-(2019-nCoV)-Spike-neutralisierender Antikörper, Maus-Mab	SinoBiological	40592-MM57