Antikörpervermittelte Neutralisation von Pseudoviren, die das Coronavirus-Spike-Protein exprimieren, unter Verwendung von Patientenserum

Zusammenfassung

Quelle: Jamieson, T. R., et al. Nachweis von SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpern mittels hochdurchsatzfähiger fluoreszenzbasierter Bildgebung der Pseudovirusinfektion. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die antikörpervermittelte Neutralisierung von Pseudoviren, die Coronavirus-Spikeproteine tragen, mithilfe von Patientenserum, untersucht durch hochdurchsatzfähige Fluoreszenzbildgebung infizierter epithelialer Zellmonolagen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probensammlung betreffen, wurden gemäß den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Antikörper- oder Serumverdünnungen und Infektionen

HINWEIS: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Neutralisierung des vesikulären Stomatitis-Virus, das das Spike-Protein des Coronavirus und das enhanced green fluorescent protein (VSV-S-eGFP) exprimiert, durch handelsübliche Antikörper und Patientenserum sowie durch von Tieren für präklinische Impfstoffentwicklungsstudien gewonnenes Serum zu messen.

1. Serielle Verdünnungsreihe
   1. Vor der Verdünnung der Serumproben jede Probe 30 min lang in einem 56 °C warmen Wasserbad hitzeinaktivieren, um das Komplementsystem zu inaktivieren. Bei der Handhabung von Patientenproben notwendige Sicherheitsvorkehrungen treffen; Probenbehälter nur im Zellkulturwerkbank abdecken und sicherstellen, dass geeignete persönliche Schutzausrüstung der Sicherheitsstufe 2 getragen wird.
   2. Die Verdünnungsreihe in einer leeren 96-Well-Platte (Platte 1) anlegen.
   3. Alle Verdünnungen in Reihe A der 96-Well-Platte mit 80 µL beginnen. *Bei Patientenproben die Verdünnungsreihe mit einer Verdünnung von 1 zu 10 beginnen, indem 8 µL Serum in 72 µL serumfreies Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (mit 1 % Penicillin/Streptomycin) gegeben werden.
      HINWEIS: Die verwendete Konzentration des neutralisierenden Antikörpers hängt von der vom Hersteller vorhergesagten Aktivität ab. Für den hier verwendeten SARS-CoV-2 Spike-neutralisierenden Antikörper (siehe Tabelle der Materialien) mit 5 µg/mL beginnen, um mindestens 50 % Neutralisation zu beobachten.
   4. 40 µL serumfreies DMEM (mit 1 % Penicillin/Streptomycin) zu den Reihen B bis G hinzufügen und 80 µL zu Reihe H. Kein Virus zu Reihe H hinzufügen, da diese als Zellen-allein-Kontrolle dient.
   5. Mit einer 12-Kanal-Mehrfachpipette 40 µL verdünntes Serum oder Antikörper aus Reihe A nach Reihe B mischen und übertragen. Mischen und Wiederholen bis Reihe F, 40 µL aus Reihe F verwerfen. Kein Serum zu Reihe G hinzufügen, da diese die Virus-allein-Kontrollreihe darstellt.
2. Infektion und Überlagerung
   1. Eine geeignete Menge verdünntes VSV-S-eGFP vorbereiten, um jedes Well mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,05 (oder 2000 Plaque-bildende Einheiten (pfu)) zu behandeln. (Bei dieser Berechnung beachten, dass nur 60 µL des gesamten 80 µL-Volumens auf die Zellen übertragen werden; daher das Virenvolumen mit 1,33 multiplizieren, um 2000 pfu beizubehalten).
      HINWEIS: Da VSV-S-eGFP temperatursensitiv ist, sicherstellen, dass die Virusbestände bei Nichtgebrauch auf Eis bleiben, und mehrfache Einfrier-Tau-Zyklen vermeiden, da die Titer nach wiederholtem Einfrieren variieren können.
   2. 40 µL verdünntes Virus zu jedem Well in den Reihen A bis G von Platte 1 hinzufügen und durch 4–5-maliges Auf- und Abpipettieren mischen. Die Platte 1 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   3. Die Platte mit den Zellen aus dem Inkubator nehmen (Platte 2) und das Medium vorsichtig aus allen Wells abziehen. 60 µL der Antikörper/Virus-Mischung von Platte 1 nach Platte 2 übertragen und 1 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren, wobei die Platte alle 20 min geschüttelt wird.
   4. Jedes Well mit 140 µL Überlagerungsmittel auffüllen, das Carboxymethylcellulose (CMC) in DMEM enthält, um eine Endkonzentration von 3 % CMC zu erreichen (mit 10 % FBS (Fetalbovinem Serum) und 1 % Penicillin/Streptomycin). Platte 2 in einen auf 34 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO₂ stellen und etwa 24 h vor der Bildaufnahme inkubieren.
      HINWEIS: Während des Infektionsschritts die Überlagerungsmischung 15 min lang in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.

2. Bildgebung und Quantifizierung (Tag 3)

1. Bildaufnahme der Platten mithilfe eines automatisierten Fluoreszenz-Imagers (unter Verwendung eines Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC)-Filters oder eines alternativen Filters mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm). Quantifizierung der Virusinfektion durch Erstellung eines Protokolls, das einzelne eGFP (enhanced green fluorescent protein)-Foci automatisch erkennt und zählt. Falls keine automatische Zählfunktion verfügbar ist, verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Anzahl der eGFP-Foci zu quantifizieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Carboxymethylcellulose	Sigma	C5678
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (Gibco)	Fisher Scientific	10-013-CV
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (Pulver) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Vero-E6-Zellen	ATCC	CRL-1586
Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS)	Fisher Scientific	21-031-CV