Überwachung der stadien-spezifischen Genexpression im Vaccinia-Virus mittels fluoreszierender Reporter

Zusammenfassung

Quelle: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia-Reporterviren zur Quantifizierung der viralen Funktion in allen Phasen der Genexpression. J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Überwachung der Vaccinia-Virusreplikation unter Verwendung fluoreszierender Reporter, die durch stadienspezifische Promotoren reguliert werden. Die sequenzielle Expression grüner, roter und blauer fluoreszierender Proteine kennzeichnet die frühen, intermediären und späten Phasen der Infektion und ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse der stadienspezifischen viralen Genexpression.

Protokoll

1. Zellen ansäen

1. Lösen Sie die HeLa-Zellen von der Platte ab und verdünnen Sie sie in Wachstumsmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-Glut, 10 % fetalem Rinderserum [FBS]) auf etwa 2,0 × 10⁵ Zellen/ml. Geben Sie 100 μl pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte mit schwarzen Wänden und klarem, flachem Boden (20.000 Zellen/Vertiefung).
2. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang, bis sie konfluent sind, in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.

2. Zellen infizieren

1. Viren verdünnen und Zellen infizieren.
   1. TrpV (Triplevirus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) und PLV (Promotor-loses Venus) fluoreszierendes Virus auftauen und durch Ultraschallbehandlung 5 Minuten lang disaggregieren. Alternativ können rohe Virustämme im Verhältnis 1:1 mit 0,25 mg/ml Trypsin in Infektionsmedium gemischt und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert werden.
   2. Rohvirenstämme in 37 °C warmem Infektionsmedium (DMEM, 2 mM L-Glut, 2 % FBS) verdünnen. Für Infektionen mit hoher Multiplizität der Infektion (MOI; 10 PFU/Zelle) den Virustock auf 1,0 × 10⁷ PFU/ml verdünnen, unter der Annahme von 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung und einem Inokulumvolumen von 50 μl. Es sollten jeweils 3 Vertiefungen pro Behandlung mit TrpV und weitere 3 Vertiefungen derselben Behandlung mit PLV infiziert werden, um die behandelungsspezifische Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen.
   3. Vertiefungen infizieren, indem 50 μl/Vertiefung verdünntes Virus in Infektionsmedium zugegeben werden. Dieser Zeitpunkt wird als 0 Stunden post Infektion (0 hpi) definiert.
2. 6–24 Stunden in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren.

3. Fixieren Sie die Zellen

1. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 μl 8 % Paraformaldehyd zu dem bereits in jedem Well enthaltenen Infektionsmedium hinzufügen. Inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 2× Paraformaldehyd (8 %) direkt dem Infektionsmedium zuzugeben, um eine Aerosolbildung infektiöser Vaccinia-Viren zu verhindern, die auftreten kann, wenn hochtitriges Medium vor der Fixierung direkt in die Abfallwanne gekippt wird.
2. Entfernen Sie das Fixativ, indem Sie die Platte in die Abfallwanne kippen.
3. Geben Sie 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei Raumtemperatur hinzu.
4. Versiegeln Sie die Platte mit einer optisch klaren Klebefolie.
   HINWEIS: Die Platten können bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort vermessen werden. Stellen Sie sicher, dass die versiegelten Platten vor der Messung auf Raumtemperatur zurückgebracht werden, um Kondensation zu vermeiden, die die Spektrophotometermessungen verfälschen könnte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetales Rinderserum – Optima, hitzeinaktiviert (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamin (L-glut)	Gibco	25030-081
96-Well-Platten mit klarem, flachem Boden, schwarzes Polystyrol, TC-behandelt	Corning	3603
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	10010-023
TempPlate RT, optisch klare Folie	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM, Medium mit reduziertem Serumanteil	Gibco	31985-070