Isolierung und Reinigung von Viren aus infizierten Insektenkörpern

Zusammenfassung

Quelle: Biesbrock, A. M. et al. Vermehrung von Homalodisca coagulata virus-01 mittels Homalodisca vitripennis-Zellkultur. J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video demonstriert die In-vitro-Vermehrung von Homalodisca coagulata Virus-01 unter Verwendung von Insekten-abstammenden Wirtszellen. Es erläutert die Schritte zur Virusreinigung, Infektion und Vermehrung innerhalb kultivierter Insektenzellen.

Protokoll

1. Extraktion des gesamten Virus

1. Homogenisieren Sie die gesamten Körper von viruspositiven H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~7,2, mit 0,02 % Natriumdiethyldithiocarbamat-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen in Intervallen von jeweils ~10 Sekunden, bis keine größeren Gewebeklumpen mehr vorhanden sind. Extrahieren Sie das Virus mittels Ultrazentrifugation bei 124.500 × g für 4 Stunden bei 4 °C oder bei 22.000 × g für 16 Stunden bei 4 °C. Falls sich ein Präzipitat an der Oberfläche bildet, entfernen Sie es mit einem sterilen Wattestäbchen.
2. Verwerfen Sie den Überstand.
3. Sammeln Sie das Pellet und lösen Sie es in 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (ohne DETCA), pH ~7,2, der 0,4 % Natriumdeoxycholsäure und 4 % Polyethylenglycol-Hexadecylether (Brij 52) enthält.
   1. Um das Pellet gut zu vermischen, lösen Sie es von der Röhrenwand ab und zerkleinern Sie es gegebenenfalls, bis es vollständig in Lösung geht.
   2. Fügen Sie bei Bedarf zusätzlichen 10 mM Phosphatpuffer in Schritten von jeweils ~5 ml hinzu, um die Lösung des Pellets zu unterstützen, und vereinigen Sie die Lösung in zwei Röhrchen.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 × g für 15 Minuten.
5. Entfernen Sie den Überstand und filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,45-μm-Filter; sammeln Sie das Filtrat in einem großen Sammelröhrchen.
6. Überführen Sie das Filtrat in eine Dialysemembran mit einer Molekulargewichtsabscheidungsgrenze (MWCO) von 3,5 kD, wobei gegebenenfalls kleine Mengen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) ohne DETCA verwendet werden können.
7. Stellen Sie die Dialysemembran in einen großen Becher, der mit ddH₂O bei 4 °C gefüllt ist. Wechseln Sie das ddH₂O stündlich über einen Zeitraum von 5 bis 6 Stunden, bis sich ein weißes Präzipitat in der Membran bildet.
8. Sammeln Sie das gereinigte Virus aus der Membran und führen Sie mit der 100-%-Viruslösung eine zehnfache Verdünnungsreihe durch, indem Sie 10 μl der Lösung zu 90 μl ddH₂O hinzufügen. Fügen Sie anschließend jeweils 10 μl der Verdünnung zu weiteren 90 μl ddH₂O hinzu, bis eine Verdünnung von 1:100.000 erreicht ist.
9. Lagern Sie die Viruslösung bei -80 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kulturgefäße für die Zellkultur von Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Oberfläche 25 cm², schräger Hals, Verschluss (Stopfenabdichtung)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Invertiertes Mikroskop und Kamera
Greiner CELLSTAR Mehrfachkulturplatten	Sigma Aldrich	M8937	48 Vertiefungen (TC-behandelt mit Deckel)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Natriumdiethyldithiocarbamat-Trihydrat
Vakuumbottelfiltersystem von Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Celluloseacetat-Membran, Porengröße 0,45 μm, Membranfläche 54,5 cm², Filterkapazität 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylenglycol-Hexadecylether
Phosphatpufferlösung	Sigma Aldrich	P5244	Erhalten als 100 mM, Verdünnung auf 10 mM mit sterilem Wasser
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insektenmedium (zusammengesetzt, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
L-Histidin-Monohydrat	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
L-Glutamin (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
MEM, Aminosäuregemisch (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
1 M MgCl-Lösung	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil
Fetales Rinderserum	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ Zikadenmedium-Bestandteil