Dieses Video demonstriert die Herstellung und Konzentration eines rekombinanten Lentivirus in Säugerzellen, wodurch eine effiziente Genübertragung von Transkriptionsfaktoren oder anderen genetischen Elementen für Anwendungen wie die zelluläre Reprogrammierung, funktionelle Untersuchungen und potenzielle therapeutische Forschung ermöglicht wird.
Methodenartikel
Erzeugung von rekombinanten Lentiviren in Säugetierzellen
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30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Aufbau eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems für Transkriptionsfaktoren
- Herstellung des konzentrierten Virus (Abbildung 1A, B)
- Plattieren Sie 1,5 × 106 HEK-293T-Zellen in eine 60-mm-Schale und kultivieren Sie diese Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. × 106 HEK (human embryonic kidney)-293T-Zellen in eine 60-mm-Schale geben und mit normalem Medium kultivieren (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂2.
HINWEIS: Falls das Virus in Chargen verpackt werden muss, kann eine 100 mm Zellkulturschale verwendet werden (Einzelheiten siehe Tabelle 2). - Nach 24 h sicherstellen, dass die HEK-293T-Zellen am Tag der Transduktion eine Konfluenz von 80–90 % erreicht haben, und das Medium durch 3,5 mL DMEM (Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium) ersetzen (150 µL von DMEM pro 1 cm²2). Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂2 für 2 h.
HINWEIS: Das Ersatzmedium muss serumfrei sein, damit die Zellen "verhungert" für eine bessere Plasmid-Transfektion. - Herstellung der Plasmidmischung (Mischung A) enthaltend 3 µg der Zielplasmide von Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 oder Snai2; 1 µg des Verpackungsplasmids PMD2.G, und 2 µg des Verpackungsplasmids PSPAX2. Stellen Sie das Volumen von Gemisch A auf 150 µL mit serumfreiem DMEM. Bereiten Sie die Mischung des Transfektionsreagenz (Mischung B) durch Zugabe von 12 µL des Transfektionsreagenz (das Volumen beträgt das Doppelte der Gesamtmasse aller Plasmide) und stellen das Volumen von Mix B auf 150 µL mit serumfreiem DMEM
HINWEIS: Beim Zubereiten der Mischungen ist es wichtig, die Flüssigkeit langsam zuzugeben, um Luftblasen zu vermeiden. - Kombinieren Sie Gemisch A und Gemisch B, nachdem sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wurden. Inkubieren Sie das Gemisch 20–30 Minuten bei Raumtemperatur, um den Transfektionskomplex zu bilden.
- Entnehmen Sie die HEK-293T-Zellen aus dem Inkubator, ersetzen Sie das Medium durch DMEM + 2 % FBS (fetales bovines Serum), geben Sie die Mischung aus Schritt 1.1.4 tropfenweise hinzu und mischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig.
- Nach 8 h das Medium durch 3,5 mL normales Medium ersetzen. Nach dem Mediumwechsel das Virusüberstand alle 24 h und 48 h sammeln.
- Mischen Sie die Virusüberstände, die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. × g 5 min bei 4 °C. Passieren Sie das Überstand durch 0.45 µm Filter und sammeln Sie es in einem sterilen 50 mL-Kegelrohr.
HINWEIS: Das nach 24 h gesammelte Virus kann bei 4 °C und mit dem Virus vereint, das nach 48 h gesammelt wurde. - Konzentrieren Sie das Virus-Überstandsvolumen durch Zentrifugation bei 6000 × g bei 4 °C über Nacht (~16 h). × g bei 4 °C über Nacht (~16 h). Stellen Sie sicher, dass sich nach der Zentrifugation ein sichtbarer Virus-Pellet am Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes befindet.
- Gießen Sie das Überstand langsam ab. Lösen Sie das Virus-Pellet in einem Volumen an normalem Medium, das 1/100 des Volumens des Virus-Überstandes beträgt.th des Volumens des Virusüberstandes. Mit einer P1000-Mikropipette vorsichtig auf- und abpipettieren, bis eine homogene Mischung erhalten ist. Den konzentrierten Virus nach Bedarf in Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen. Bei −80 °C.
HINWEIS: Das Virus wird mit dieser Methode 100-fach konzentriert. Das konzentrierte Virus (100x) kann für mehr als ein Jahr bei −80 °C gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus sollte vermieden werden. >1 Jahr bei −80 °CVermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus.
- Plattieren Sie 1,5 × 106 HEK-293T-Zellen in eine 60-mm-Schale und kultivieren Sie diese Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. × 106 HEK (human embryonic kidney)-293T-Zellen in eine 60-mm-Schale geben und mit normalem Medium kultivieren (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂2.
Tabelle 1: Bestandteile von normalem Medium und Reprogrammiermedium.
| Komponenten | Dosis (Konzentration, Volumen) | Endkonzentration | |
| Normales Medium (100 mL) | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 mL | |
| Hitzeinaktiviertes FBS | 10 mL | ||
| Antibiotika (Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| Reprogrammierungsmedium (100 mL) | RPMI-1640 | 88 mL | |
| Hitzeinaktiviertes FBS | 10 mL | ||
| Rekombinanter humaner SCF | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| Rekombinanter humaner bFGF | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| Rekombinanter humaner Insulin | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 human | 100 μM, 100 μL | 0.1 μM | |
| Cholera-Toxin | 0.3 mg/mL, 0.56 μL | 20 pM | |
| Phorbol-12-myristat-13-acetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrocortison | 100 μg/mL, 500 μL | 0.5 μg/mL | |
| Adenin | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
Tabelle 2: Einzelheiten des Lentivirus-Verpackungssystems.
| Kulturschale | Ausgangsdichte (Zellen/Schale) | Medium (mL) | Plasmidsystem | Transfektionsreagenz (µL) | ||
| Zielplasmid (μg) | PMD2.G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Ergebnisse
Abbildung 1: Herstellung konzentrierten Virus und Bestimmung der Titration. (A) Fluoreszenzintensität von GFP (grünes Fluoreszenzprotein) nach Infektion von HEK-293T-Zellen mit unkonzentriertem Lentivirus (1x) und konzentriertem Lentivirus (100x) (B) Vergleich der Infektionsraten von unkonzentriertem Lentivirus (1x) und konzentriertem Lentivirus (100x), detektiert mittels Durchflusszytometrie. (C) Titrierung von konzentriertem Lentivirus. Maßstabsbalken = 250 µm. Abkürzungen: GFP = grünes Fluoreszenzprotein; TU = transduzierende Einheiten.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μM-Filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 95 %/100 % Ethanol | LANBAO | 210106 | Aufbewahrung bei RT |
| Antibiotika (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Aufbewahrung bei -20 °C |
| Anti-TRP2/DCT-Antikörper | Abcam | ab74073 | Wirt/Isotyp: Kaninchen-IgG; Spezies-Reaktivität: Maus/Mensch; Verdünnung 1:200 zur Verwendung |
| DMEM (hoher Glukosegehalt) | HyClone | SH30243.01 | Aufbewahrung bei 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Aufbewahrung bei RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Aufbewahrung bei -20 °C; vor Gebrauch hitzeinaktiviert |
| Gelatine | Sigma | G9391 | Aufbewahrung bei RT |
| GFP-PURO-Plasmide (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Aufbewahrung bei -20 °C |
| Hämatoxylin | Abcam | ab220365 | Aufbewahrung bei RT |
| Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfektionsreagenz, Aufbewahrung bei 4 °C |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Aufbewahrung bei RT |
| Phorbol-12-myristat-13-acetat (TPA) | Sigma | P8139 | Stammlösungskonzentration 1 mM; Endkonzentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | kationisches polymeres Transfektionsreagenz; Stammlösungskonzentration 8 μg/µL; Endkonzentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Aufbewahrung bei -20 °C |
| Rekombinanter humaner bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stammlösungskonzentration 4 μg/mL; Endkonzentration 10 ng/mL |
| Rekombinanter humaner Insulin | Sigma | I3536 | Stammlösungskonzentration 10 mg/mL; Endkonzentration 5 µg/mL |
