In diesem Video wird gezeigt, wie ein tetracistronisches Minigenom-Plasmid, das das Genom des Ebola-Virus nachahmt, zusammen mit Hilfsplasmiden in humane Zellen transfiziert wird. Innerhalb der Zellen werden virale Proteine und Luciferase exprimiert, was zur Assemblierung und Ausknospung nicht-pathogener, replikationskompetenter Virus-ähnlicher Partikel führt.
Methodenartikel
Herstellung von Reporter-enthaltenden, transkriptions- und replikationskompetenten Ebola-Virus-ähnlichen Partikeln
36 Aufrufe
⸱
30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Transfektion von Produzentenzellen zur initialen Herstellung von transkriptions- und replikationskompetenten virusähnlichen Partikeln oder trVLPs
- 24 Stunden nach dem Aufteilen der Zellen (siehe Abbildung 1 für einen Überblick über den zeitlichen Ablauf des Experiments) pipettieren Sie Plasmid-DNA (für Mengen siehe Tabelle 1) unter Verwendung von gefilterten Spitzen in ein steriles 2-mL-Cryoröhrchen. Geben Sie 100 µL OptiMEM pro Vertiefung zur DNA hinzu. Vortexen Sie das Gemisch kurz und zentrifugieren Sie die Röhrchen vorsichtig in einer Mikrozentrifuge. Falls mehrere Vertiefungen mit identischen Plasmiden transfiziert werden sollen, kann ein Master-Mix für mehrere Vertiefungen hergestellt werden.
- Vortexen Sie das Röhrchen mit Transit LT1 vor der Verwendung kurz. Geben Sie 7,5 µL Transit LT1 pro Vertiefung zur verdünnten DNA hinzu. Vortexen Sie das Gemisch vorsichtig, wobei darauf geachtet werden sollte, dass sich keine Flüssigkeit im Deckel des Cryoröhrchens sammelt, und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Mischen Sie den Transfektionskomplex vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Geben Sie 100 µL der Transfektionskomplexe tropfenweise in jede Vertiefung. Schwenken Sie die Platte vorwärts/rückwärts und von Seite zu Seite, um die Transfektionskomplexe zu verteilen. Drehen Sie die Platte nicht im Kreis, da dies zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Transfektionskomplexe führen würde.
- Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
- Nach 24 Stunden entfernen Sie das Überstandmedium von den Zellen. Geben Sie 4 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit 5 % FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-Glutamin und 1x Pen/Strep (Penicillin/Streptomycin) (DMEM5) zu den Zellen hinzu. Dieser Schritt kann für bis zu drei Vertiefungen gleichzeitig durchgeführt werden, ohne dass die Vertiefungen austrocknen, vorausgesetzt, die Vertiefungen enthalten identische Proben (anderenfalls kann aufgrund der selbstverstärkenden Natur der trVLPs (Transkriptions- und replikationskompetenten virusähnlichen Partikel) in diesem System eine Kreuzkontamination auftreten, und dieser Schritt sollte dann einzeln pro Vertiefung durchgeführt werden).
- Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
Tabelle 1. DNA-Mengen für die Transfektion. Die Menge jedes Plasmids, die für die Transfektion von Produzenten- und Zielzellen erforderlich ist, ist in ng pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte angegeben.
| Produzentenzellen (p0) | Target-Zellen (p1 und höher) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1.000 | 1.000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Ergebnisse
Abbildung 1. Zeitplan eines tetracistronischen trVLP-Assays über drei aufeinanderfolgende Passagen. Die Tage für das Aussäen der Zellen (s), die Transfektion der Zellen (t), die Infektion der Zellen (i), den Mediumwechsel (c) sowie die Ernte von Zellen und trVLPs (h) sind für drei aufeinanderfolgende Passagen (durch Pfeile gekennzeichnet) angegeben.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 75 cm² Zellkulturflasche | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | 30 Minuten bei 56 °C hitzeinaktivieren |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 6-Well-Platten | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
