Luciferase-basierter Assay zur Evaluierung antiviraler Verbindungen in menschlichen embryonalen Nierenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Lucas-Hourani, M. et.al., Hochdurchsatz-Screening für breitbandige chemische Inhibitoren von RNA-Viren. J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video zeigt einen auf Luciferase basierenden antiviralen Assay in menschlichen embryonalen Nierenzellen, die mit einem rekombinanten Masernvirus infiziert wurden. Es zeigt, dass seriell verdünnte Testsubstanzen die virale Replikation hemmen, was zu einer dosisabhängigen Verringerung der Lumineszenz führt, während die Lebensfähigkeit der Wirtszellen erhalten bleibt.

Protokoll

1. Herstellung von Zellkulturen, die mit dem Masernvirus (MV), das Feuerfliegen-Luciferase (rMV2/Luc) exprimiert, infiziert wurden

1. Züchten Sie HEK-293T-Zellen bei 37 °C und 5% CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagleschem Medium (DMEM) mit stabilisiertem L-Glutamin und ergänzt mit 10% Fötalem Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 μg/ml) und Penicillin (100 IE/ml). Die Zellen werden alle 4–5 Tage durch Trypsinisierung weitergeimpft und im Verhältnis 1:10 in eine neue Flasche verdünnt. Für Experimente sollten sich die Zellen in der log-Phase befinden.
2. Am Tag des Experiments gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinisierung und führen eine Zellzählung durch. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie sie mit 3 x 10⁵ Zellen/ml in Kulturmedium. Berücksichtigen Sie, dass 12,5 ml Zellsuspension pro Screening-Platte benötigt werden.
3. Resuspendieren Sie die Zellen erneut mit 3 x 10⁵ Zellen/ml in Kulturmedium. Berücksichtigen Sie, dass 12,5 ml Zellsuspension pro Screening-Platte benötigt werden.
4. Optional: ergänzen Sie das Kulturmedium mit Uridin (20 μg/ml).
   HINWEIS: Bei der Untersuchung chemischer Bibliotheken auf Hemmstoffe der Virusreplikation werden häufig Verbindungen gefunden, die frühe Schritte der Pyrimidinbiosynthese hemmen. Die Zugabe von Uridin zum Kulturmedium dient dazu, solche antiviralen Substanzen auszuschließen. Tatsächlich wird dadurch die Virusreplikation effizient wiederhergestellt, wenn upstream liegende Enzyme des Pyrimidinbiosynthesewegs blockiert sind.
5. Heben Sie 1:10 der Zellsuspension für Kontrollmulden mit nicht infizierten Zellen auf und infizieren Sie das verbleibende Volumen.
6. Tauen Sie das geeignete Volumen der rMV2/Luc-Stammlösung auf. MV-Stammlösungen enthalten üblicherweise 10⁶–10⁸ infektiöse Partikel pro ml. Die Kultur muss mit 0,1 infektiösen Partikeln von rMV2/Luc pro Zielzelle infiziert werden, was einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 entspricht. 
   HINWEIS: rMV2/Luc stammt aus dem MV-Impfstoff (Schwarz-Stamm) und wird in einer BSL-2-Umgebung manipuliert.
7. Geben Sie das Virus zur Zellsuspension und mischen Sie vorsichtig. Überführen Sie die infizierten Zellen in einen Vorratsbehälter und geben Sie 100 μl infizierte Zellsuspension in die Spalten 2 bis 11 von D2-Platten, die mit chemischen Substanzen versetzt sind. Die Zellsuspension im Vorratsbehälter wird regelmäßig vorsichtig gemischt.
8. Geben Sie in die Spalten 1 und 12 jeweils 100 μl nicht infizierter Zellen in jede Mulde. In die übrigen Mulden wird infizierte Zellsuspension pipettiert.
9. Die Zellen 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren.

2. Sekundärtest für Toxizität und breitbandige antivirale Aktivität

1. Stellen Sie 1:2-Verdünnungsreihen für jede Wirkstoffverbindung in Dimethylsulfoxid (DMSO) her, beginnend bei 500 µM bis 4 µM (8 Verdünnungen). Füllen Sie weiße, barcodierte Zellkulturplatten mit jeweils 50 µl Kulturmedium. Geben Sie 1 µl jeder Verbindungsdilution in die Kulturbrunnen. Wiederholen Sie dies zweimal, sodass drei Zellkulturplatten mit duplizierten Verdünnungsreihen für jede Wirkstoffverbindung vorliegen.
2. Bereiten Sie 37,5 ml einer HEK-293T-Zellsuspension mit 6 x 10⁵ Zellen/ml im Kulturmedium wie oben beschrieben (in 1.1 und 1.2) vor. Portionieren Sie 2x 12,5 ml in Falcon-Röhrchen und infizieren Sie die Zellen entweder mit rMV2/Luc bei einem MOI = 0,1 oder mit dem rekombinanten Chikungunya-Virus (CHIKV), das Renilla-Luciferase exprimiert (CHIKV/Ren), bei einem MOI = 0,2. Mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen.
   HINWEIS: CHIKV/Ren stammt von einem Wildtyp-Stamm von CHIKV ab und muss daher in einer BSL3-Umgebung gehandhabt werden. Die Platten können nach Zugabe des Renilla-Substrats zu den Kulturbrunnen (siehe unten) von BSL3 nach BSL1 verbracht werden.
3. Geben Sie jeweils 50 µl nicht infizierter, mit rMV2/Luc infizierter oder mit CHIKV/Ren infizierter Zellen in Zellkulturplatten, die serielle Verdünnungen der Wirkstoffverbindungen enthalten. Inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C.
4. Fügen Sie 50 µl Glühwürmchen-Luciferase-Substrat hinzu, um die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität in mit rMV2/Luc infizierten Brunnen zu bestimmen. Fügen Sie 50 µl Renilla-Luciferase-Substrat hinzu, um die Renilla-Luciferase-Aktivität in mit CHIKV/Ren infizierten Brunnen zu bestimmen. Geben Sie abschließend 50 µl lebendzellbasiertes Luciferase-Vitalitäts-Assay-Reagenz zu den nicht infizierten Zellen, um die zelluläre Vitalität zu bestimmen.
5. Tragen Sie die Daten ein (Abbildung 1) und ermitteln Sie die Konzentrationen der Wirkstoffverbindungen, die die Replikation von MV und CHIKV um 50 % hemmen. Verwerfen Sie Verbindungen, die in diesem Assay toxische Wirkung zeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Dosis-Wirkungs-Kurve der antiviralen Aktivität und Toxizität der Verbindungen C864, C648 und C062. (A) HEK-293T-Zellen wurden mit dem rMV2/Luc-Stamm von MV, der Luciferase exprimiert (MOI=0,1), infiziert und mit steigenden Dosen von C864, C648, C062 oder allein mit DMSO inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Luciferase-Expression bestimmt. * zeigt an, dass die beobachteten Luciferase-Hemmungen mit allen drei Verbindungen statistisch signifikant waren (p-Werte < 0,05). (B) HEK-293T-Zellen wurden mit dem CHIKV/Ren-Stamm von CHIKV, der Renilla-Luciferase exprimiert (MOI=0,2), infiziert und mit steigenden Dosen von C864, C648, C062 oder allein mit DMSO inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Renilla-Luciferase-Expression bestimmt. * zeigt statistisch signifikante Hemmungen mit allen drei Verbindungen an (p-Werte < 0,05). (C) HEK-293T-Zellen wurden mit steigenden Dosen von C864, C648, C062 oder allein mit DMSO inkubiert. Als Kontrolle für Toxizität wurden die Zellkulturen mit 2,5 μl einer 0,5 %igen IGEPAL-Lösung versetzt. Nach 24 Stunden wurde die Anzahl lebender Zellen mittels eines auf Luciferase basierenden Vitalitätsassays bestimmt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Freedom-EVO-Plattform	TECAN		Roboterplattform
96-Well-Polystyrol-Zellkulturmikroplatten, weiß	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo lumineszierender Zellviabilitätsassay	Promega	G7570	Luziferasebasierter Viabilitätsassay
Bright-Glo-Luziferase-Assay-System	Promega	E2610	Reagenz enthaltend Firefly-Luziferase-Substrat
Renilla-Glo-Luziferase-Assay-System	Promega	E2710	Reagenz enthaltend Renilla-Luziferase-Substrat
Britelite-plus-Reportergen-Assay-System	Perkin-Elmer	6016761	Reagenz enthaltend Firefly-Luziferase-Substrat. Kann als Alternative zum Bright-Glo-Reagenz zur Bestimmung der Luziferase-Aktivität verwendet werden.