Isolierung eines einzelnen Riesenvirus aus einer gemischten Viruspopulation unter Verwendung von Amöben

Zusammenfassung

Quelle: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Einzelzell-Mikroaspiration als alternative Strategie zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung zur Trennung von Gemischen riesiger Viren. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video wird die Einzelzell-Mikroaspiration zur Isolierung und Anzucht einer einzelnen Riesenviruspopulation aus einer gemischten Viruspopulation unter Verwendung von Amöben als Wirtszellen demonstriert.

Protokoll

1. Amöbenkultur

1. Verwenden Sie Vermamoeba vermiformis (Stamm CDC19) als Zellunterlage.
2. Geben Sie 30 mL Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glucose-Medium (PYG) (Tabelle 1) und 3 mL der Amöben mit einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/mL in einen 75 cm² Zellkulturgefäß.
3. Halten Sie die Kultur bei 28 °C.
4. Quantifizieren Sie nach 48 h die Amöben mithilfe von Zählkammern.
5. Spülen Sie, indem Sie die Zellen bei einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/mL sammeln und die Amöben durch Zentrifugation bei 720 x g für 10 min pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem entsprechenden Volumen an Nährstoffentzogenem Medium, um 1 x 10⁶ Zellen/mL zu erhalten (Tabelle 1).

2. Endpunktverdünnung

1. Führen Sie eine serielle Verdünnung (10^-1 bis 10^-11) der Virusprobe in Nährstoffentzugsmedium durch (Tabelle 1).
2. Inokulieren Sie 2 mL von 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis in jede Petrischale mit 100 µL der Inokulum-Mischung.
3. Stellen Sie die Petrischalen in einen verschließbaren Plastikbeutel bei 30 °C.
4. Beginnen Sie 6 Stunden nach der Infektion mit der Beobachtung der Petrischalen mittels invertierter optischer Mikroskopie und überprüfen Sie alle 4 bis 8 Stunden die Zellmorphologie.
5. Bei Auftreten des zytopathischen Effekts, gekennzeichnet durch abgerundete Zellen, beginnen Sie den Einzelzell-Mikroaspirationsprozess.

3. Einzelzell-Mikroaspiration

1. Bereiten Sie den Wirt vor
   HINWEIS: Diese Vorbereitung dient der Freisetzung infizierter Einzelzellen auf eine frische Zellunterlage.
   1. Behandeln Sie die Amöben in der Kultur mit einem antimikrobiellen Wirkstoff, der 10 µg/mL Vancomycin, 10 µg/mL Imipenem, 20 µg/mL Ciprofloxacin, 20 µg/mL Doxycyclin und 20 µg/mL Voriconazol enthält. Diese Mischung dient zur Vermeidung bakterieller und pilzlicher Kontamination.
      HINWEIS: Der Vorgang erfolgt auf einem Arbeitstisch außerhalb der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank. Geben Sie jeweils 2 mL konzentrierter Amöben (1 x 10⁶ Zellen/mL) in 15 Petrischalen. Inkubieren Sie die Kultur zur Adhärenz der Amöben 30 Minuten bei 30 °C.
2. Wählen Sie die für die Mikroaspiration verwendete Petrischale aus der Grenzverdünnung gemäß folgender Kriterien aus: 1) Fehlen jeglicher sichtbarer Kontamination durch pilzliche und bakterielle Erreger, 2) Nachweis eines zytopathischen Effekts an den Amöben infolge der Viren und 3) Prälyse- und Abrundungsphase der Amöben (um die Aspiration von Viruspartikeln zu vermeiden).
3. Richten Sie eine Arbeitsstation mit folgenden Materialien ein (Abbildung 1A,B): Mikromanipulator zur Positionierung der Mikrokapi­llare; manuelles Drucksteuergerät zum Aspirieren und Freisetzen der Zellen in die Mikrokapi­llare; inverses Mikroskop; Plug-and-Play-Motormodule; Kamera; Computermodule zur Visualisierung der Manipulation und Aufnahme von Bildern.
4. Wählen Sie eine Mikrokapi­llare aus (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Die Zellgröße, die Deformation und Adhäsion der Membranen an Oberflächen sowie die Zellmotilität können den reibungslosen Ablauf der Mikroaspiration beeinflussen. Der Durchmesser der Mikrokapi­llare kann präzise je nach Zelltyp, Größe und Aspirationsmethode gewählt und angepasst werden. Zur Aspiration einer abgerundeten Amöbe (Durchmesser ~10 µm) wurde eine Mikrokapi­llare mit einem Innendurchmesser von 20 µm verwendet. Dies ermöglicht eine stabile Positionierung innerhalb der Kapillare und eine einfache Freisetzung der Zelle.
5. Montieren Sie das System.
   1. Stellen Sie den Arbeitswinkel des Greifsystems am motorisierten Modul auf 45° ein.
   2. Nehmen Sie eine Doppelmontage vor, zuerst am Greifsystem und anschließend an der Mikrokapi­llare.
   3. Fokussieren Sie die Zellen, nachdem Sie einige Tropfen Öl durch die Mikrokapi­llare gegeben haben.
      HINWEIS: Das biologisch verträgliche Mineralöl wird vom Gerät bereitgestellt.
   4. Schließen Sie die Montage gemäß den Herstellerempfehlungen ab.
6. Klonen Sie die Zellen (Abbildung 2A,B)
   1. Platzieren Sie die Petrischale mit 2 mL infizierter Amöben unter dem Mikroskop.
   2. Fokussieren Sie zuerst die Zellen und danach die in der Kultur befindliche Mikrokapi­llare.
   3. Wählen Sie eine einzelne abgerundete Zelle aus und führen Sie die Mikrokapi­llare näher an den Mikromanipulator heran.
   4. Üben Sie eine sanfte Aspiration mittels manueller Drucksteuerung auf die Zelle aus, um sie in die Mikrokapi­llare aufzunehmen. Entfernen Sie die Einzelzelle aus der ersten Probe und geben Sie sie in die Zellunterlage frei, anschließend inkubieren Sie sie bei 30 °C.
   5. Führen Sie tägliche Beobachtungen mit einem inversen optischen Mikroskop durch, um das Erscheinungsbild der Zellen zu überprüfen und das Auftreten des zytopathischen Effekts zu überwachen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Kulturmedien

Ergebnisse

Abbildung 1: Materialien für die Mikromanipulation. (A) Tatsächliche Anordnung der Arbeitsstation. (B) Schematische Darstellung der Komponenten der Arbeitsstation. (C) Schematische Darstellung der Mikrokapi­llare.

Abbildung 2: Schritte der Mikroaspiration. (A) Verfahren zur Einzelzell-Isolierung (Vergrößerung x40). (B) Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte der Einzelzell-Aspiration: 1) Lokalisierung der Zelle. 2) Aspiration der Zelle. 3) Freisetzungsschritt. Die schwarzen Pfeile zeigen die Mikrokapi­llare und die weißen Pfeile die Einzelzelle.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kultivierungsflaschen für Zellkulturen, 150 cm², Corning	Sigma-aldrich	CLS430825	Kultivierung
Kultivierungsflaschen für Zellkulturen, 25 cm², Corning	Sigma-aldrich	CLS430639	Kultivierung
Kultivierungsflaschen für Zellkulturen, 75 cm², Corning	Sigma-aldrich	CLS430641	Kultivierung
Kamera DFC 425C	LEICA	Unkown	Beobachtung/Überwachung
Invertiertes Mikroskop Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Beobachtung/Überwachung
Mikrokapi­llare, 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Mikroaspiration und Freisetzung von Zellen
Mikromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Positionierung der Mikrokapi­llare
Petri-Schale, 35 mm	Ibidi	81158	Kultivierung/Beobachtung