Fluoreszenzbasierte Sortierung einzelner Viruspartikel für die genomische Analyse

Zusammenfassung

Quelle: Zeigler Allen, L., et al. Isolierung und Genomanalyse einzelner Virionen mittels „Single Virus Genomics“ J. Vis. Exp. (2013).

Dieses Video zeigt, wie die Durchflusszytometrie die Isolierung einzelner, genomhaltiger Viren aus gemischten Populationen durch fluoreszenzbasierte Detektion und präzise Partikelsortierung ermöglicht, gefolgt von der Einbettung in Agarose für die anschließende genomanalytische Charakterisierung.

Protokoll

1. Herstellung von Viruspräparationen

Vor der Isolierung einzelner Virionen mittels Durchflusszytometrie müssen ungefrorene virale Suspensionen hergestellt werden.

1. Isolieren Sie virale Partikel unter Verwendung bereits etablierter Protokolle, wobei sichergestellt werden muss, dass die endgültige virale Suspension in 0,1 μm-gefiltertem TE (Tris-EDTA, pH 8) enthalten ist. Wir empfehlen die Verwendung von Tangentialflussfiltrationsverfahren (TFF), obwohl auch andere Methoden entwickelt wurden, die chemische Flockung nutzen.
2. Zählen Sie virale Partikel mithilfe etablierter Protokolle, z. B. mittels Epifluoreszenz 8–10 oder Durchflusszytometrie.
3. Geben Sie die virale Suspension portionsweise in zwei Eppendorf-Röhrchen (empfohlene Endvolumina: 1.000 μl).

2. Durchflusszytometrie

1. Um Viren mithilfe des BD FACSAria II-Fluoreszenz-Aktivierter Zellsortierers (Durchflusszytometer) mit einem kundenspezifischen Vorwärtsstreuungs-Photomultiplier (FSC PMT) zu sortieren, verdünnen Sie die Viruspartikel in 0,1 μm-gefiltertem TE-Puffer, pH 8,0, auf eine geeignete Titerkonzentration für eine Ereignisrate von 200 Ereignissen pro Sekunde (sec^-1).
2. Stellen Sie die Schwellenwerte so ein, dass das Signal-Rausch-Verhältnis maximiert wird; beispielsweise wird für ein Gemisch, das T4- und Lambda-Phagenpartikel enthält, Folgendes empfohlen: FSC PMT bei 1.000 und SSC bei 200.
3. Führen Sie 100 μl „Leerproben“ durch, die nur enthalten: 1) 0,1 μm-gefiltertes TE und 2) 0,1 μm-gefiltertes TE mit SybrGreen1 in einer Verdünnung von 1:10.000 (1e-4 der Stammlösung, 10.000X).
4. Führen Sie eine kleine Aliquotprobe (100 μl werden empfohlen) der ungefärbten Viruslösung durch, um den Hintergrund zu bewerten, gefolgt von der gefärbten Viruslösung (SybrGreen1 in einer Verdünnung von 1e-4 der Stammlösung), jeweils bis zu insgesamt 5.000 Ereignissen (Viruspartikeln). Dies dient der Überprüfung der Konzentration und gegebenenfalls der Anpassung der Sortiergatter vor der eigentlichen Sortierung. Wir empfehlen ein enges Gatter im Zentrum der Viruspartikel. Außerdem verwenden wir zur Erstellung der Gatter das SYBR Green- und FSC PMT-Diagramm.
5. Geben Sie jeweils 5 μl 1 %iger Niedrigschmelzpunkt-(LMP-)Agarose (in TBE-Puffer), abgekühlt auf 37 °C, in jedes Loch eines Polytetrafluorethylen-(PTFE-)Objektträgers (Electron Microscopy Sciences).
6. Platzieren Sie den PTFE-Objektträger in das Durchflusszytometer, um die sortierten Viruspartikel einzufangen.
7. Beginnen Sie mit der Sortierung der mit SYBR Green gefärbten Viruspartikel direkt auf den PTFE-Objektträger mit LMP-Agarose. Es wird empfohlen, in einigen Löchern 10 oder mehr Ereignisse (Viruspartikel) zu sortieren, um die Detektion der Tiefenlage der Viren während der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CSLM) zu erleichtern.
8. Nach Abschluss der Sortierung entfernen Sie den Objektträger aus dem Durchflusszytometer und geben jeweils weitere 5 μl LMP-Agarose, abgekühlt auf 37 °C, in jedes Loch, wodurch die Viruspartikel eingebettet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1X-TE-Puffer	Invitrogen	12090-015
Phenol, Puffer-gesättigt	Invitrogen	15513-039
LMP-Agarose	Invitrogen	16520100
PTFE-Mikroskopobjektträger	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24-Loch, 4 mm Durchmesser
β-Agarase	New England Biolabs	M0392S