Amöbenbasierte Anreicherung von Riesenviren aus einer Umweltwasserprobe

Zusammenfassung

Quelle: Bou Khalil, J. Y.,et al. Eine schnelle Strategie zur Isolierung neuer Faustoviren aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Anreicherung von Riesenviren aus einer Umwasserprobe mithilfe einer amöbenbasierten Kultur zur anschließenden Detektion und Analyse.

Protokoll

1. Probenahme

1. Sammlen Sie 70 Proben aus verschiedenen Umgebungen und Regionen. Verwenden Sie in diesem Fall Folgendes: 5 Schmutzwasserproben aus dem Dorf Saint Pierre de Meyzoargues (Frankreich), 15 Proben aus dem See im Parc Borély in Marseille (Frankreich); 15 Meerwasserproben mit Sediment aus den felsigen Buchten bei Samena in Marseille (Frankreich), 25 Flusswasserproben aus den Alpen (Frankreich) und schließlich 10 Proben aus Abwasser in La Ciotat (Frankreich).
2. Vortexen Sie die Proben zur Homogenisierung vor der Inokulation eine Minute lang bei Raumtemperatur, ohne weitere Behandlung.

2. Isolierungsverfahren

1. Wirtsvorbereitung für Kulturen ohne Sichtkontrolle und Probeneinsaat
   1. Verwenden Sie Vermamoeba vermiformis (Stamm CDC19) als Zellunterlage für die Ko-Kultur.
   2. Pflegen Sie die Amöben bei 28 °C in einer 75 cm²-Zellkulturschale mit 30 ml Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glukose-Medium (PYG). Überprüfen Sie die Zusammensetzung von PYG in Tabelle 1.
      HINWEIS: Nach 48 Stunden werden die Amöben durch eine Standardzählung mit Zählkammern (z. B. Kovaslides) quantifiziert.
   3. Sammlung der Zellen in einer Konzentration von 5 × 10⁵ bis 10⁶ Zellen/ml und Pellettieren der Amöben durch Zentrifugation bei 720 × g für 10 min.
   4. Entfernen Sie das Überstandsvolumen durch Absaugen und resuspendieren Sie das Amöbenpellet in 30 ml steriler Page-Amöben-Salzlösung (PAS) Tabelle 1. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang.
   5. Resuspendieren Sie die Amöben in 30 ml Nährstoffentzugsmedium mit einer antibiotischen und antimykotischen Mischung in einer Konzentration von etwa 10⁶ Amöben/ml. Das Nährstoffentzugsmedium dient als Überlebensmedium für die Amöben und ermöglicht es ihnen, lebendig zu bleiben, ohne zu zystieren oder sich zu vermehren. Überprüfen Sie die Zusammensetzung in Tabelle 1.
      HINWEIS: Die antimikrobielle Mischung enthielt 10 µg/ml Vancomycin, 10 µg/ml Imipenem, 20 µg/ml Ciprofloxacin, 20 µg/ml Doxycyclin und 20 µg/ml Voriconazol. Diese Mischung diente dazu, bakterielle und pilzliche Kontaminationen zu reduzieren, die die virale Vermehrung beeinträchtigen oder verändern könnten.
   6. Inokulieren Sie direkt 25 µl jeder Probe auf die 200 µl Amöben-Monolayer in einer 96-Loch-Platte mit flachem Boden, die die Anheftung der Amöben begünstigt, und inkubieren Sie bei 30 °C in einer feuchten Umgebung (eine feuchte Umgebung wird erreicht, indem ein feuchtes Tuch in den Beutel mit der Platte gelegt wird, um Verdunstung zu vermeiden). Dies ist die Erstkultur. Belassen Sie zwei Vertiefungen mit Amöben ohne Probeneinsaat; dies dient als negativer Kontrollansatz. Inkubieren Sie diese Erstkultur drei Tage lang.
   7. Drei Tage nach der ersten Einsaat übertragen Sie die Erstkultur auf frische Amöben wie oben beschrieben, ohne mikroskopische Untersuchung. Inkubieren Sie die neue Platte drei Tage lang unter denselben Bedingungen wie die Erstkultur.
   8. Führen Sie nach diesen drei Inkubationstagen die Endkultur genauso wie die Erst- und Sekundärkultur durch. Inkubieren Sie die Endkultur zwei Tage lang. Fahren Sie anschließend mit der Detektion fort.

Tabelle 1. Rezepte für Lösungen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glukose-Medium (PYG), Page-Amoben-Salzlösung (PAS), Hungersalzlösung	In-house-Laborherstellung	Marseille URMITE	x
Amoben-Stamm CDC-19	ATCC	Frankreich	50237
Platten	Cellstar	Frankreich	655180
Flaschen	SARSTEDT	Deutschland	833911
Ultrazentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	Frankreich	9102448