Quantifizierung des infektiösen Hepatitis-C-Virus mittels Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Ren, S., et al. Ein Protokoll zur Analyse der Replikation des Hepatitis-C-Virus. J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video demonstriert den Fluoreszenz-Fokus-Assay, der zur Quantifizierung infektiöser Hepatitis-C-Viren in Zellkultur verwendet wird. Es zeigt die serielle Verdünnung des viralen Überstandes, die Infektion von Hepatomzellen und den Nachweis von Virusreplikationsstellen mittels antikörperbasierter Fluoreszenzmikroskopie.

Protokoll

1. Bestimmung der Virus-Titer

1. Impfen Sie naive Huh-7.5.1-Zellen mit etwa 3 x 10³ Zellen/Vertiefung in einer 96-Loch-Platte aus. Führen Sie am nächsten Tag zehnfache serielle Verdünnungen des zellfreien Kulturüberstandes, der aus mit Hepatitis-C-Virus-(HCV-)RNA-transfizierten Zellen gewonnen wurde, mit Wachstumsmedium durch und impfen Sie diese in dreifacher Ausführung auf Huh-7.5.1-Zellen auf.
2. Fixieren Sie die Zellen 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol (30 Minuten bei -20 ºC) und führen Sie eine Immunfärbung für das HCV-NS5A-Protein durch.
3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und blockieren Sie sie mit IFA-Blockierpuffer.
4. Verwenden Sie einen Kaninchen-polyklonalen primären Anti-NS5A-Antikörper oder einen Maus-monoklonalen Anti-dsRNA-Antikörper J2 in einer Verdünnung von 1:200 (1 μg/ml) und inkubieren Sie 5 Stunden bis über Nacht bei 4 ºC.
5. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit dem primären Antikörper dreimal mit PBS.
6. Fügen Sie einen Ziegen-polyklonalen sekundären Antikörper gegen Kaninchen-IgG-488 oder einen Ziegen-polyklonalen sekundären Antikörper gegen Maus-IgG-594 in einer Verdünnung von 1:1.000 (1 μg/ml) hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur.
7. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und betrachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
8. Verwenden Sie die höchste Verdünnung, um die NS5A-positiven Foci zu zählen, und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl an fokusbildenden Einheiten (FFU) pro Milliliter. Siehe Abbildung 1 für die HCV-Titerbestimmung.

Ergebnisse

Abbildung 1. Untersuchung der Infektiosität von wildtypischem HCV und Bestimmung der Virus-Titer. A) Naive Huh-7.5.1-Zellen wurden für Infektionsstudien verwendet. Das zellfreie Überstandmedium, das 48 bzw. 96 Stunden nach der Transfektion (hpt) mit HCV-RNA gewonnen wurde, wurde einer 10-fachen seriellen Verdünnung unterzogen und in dreifacher Ausführung auf Zellen in einer 96-Well-Platte aufgebracht. 72 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und mittels Immunfärbung für das HCV-NS5A-Protein detektiert. Zellen mit positiver NS5A-Färbung (rot) sind mit dem Virus infiziert. Zur Bestimmung der fokusbildenden Einheiten (FFU) wurden die positiven Foci bei der höchsten Verdünnung gezählt. Repräsentative Bildausschnitte sind dargestellt (Maßstab: 100 μm). B) Im Diagramm sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des viralen Titer in FFU pro Milliliter aufgetragen. Der Polymerase-Null-Mutant produzierte keine infektiösen Partikel. WT: Wildtyp; Pol-: Polymerase-Null.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		Die Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Francis Chisari an Dr. Arumugaswami im Rahmen einer ausgeführten MTA zwischen The Scripps Research Institute und Cedars-Sinai Medical Center zur Verfügung gestellt
Maus-monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Ziegen-Anti-Kanin-IgG-Alexa-Fluor-488	Life Technologies	A11008
Ziegen-Anti-Kanin-IgG-Alexa-Fluor-594	Life Technologies	A11020