In diesem Video wird die Anwendung der Click-Chemie und der Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der neu gebildeten RNA-Transkription in Säugetierzellen gezeigt. Es verdeutlicht, wie eine Virusinfektion die Wirtstranskription unterdrückt, indem fluoreszierende Signale zwischen infizierten und Kontrollzellen verglichen werden.
Methodenartikel
Visualisierung der transkriptionellen Supprimierung in virusinfizierten Zellen
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30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Infizieren Sie Zellen mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV)-Stamm MP-12 und markieren Sie neu synthetisierte RNA mit 5-Ethynyluridin (EU)
- Säen Sie humane embryonale Nierenzellen 293 (HEK293) in eine 6-Loch-Gewebekulturplatte in Wachstumsmedium (Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin). Inkubieren Sie im feuchten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 bis die Zellen eine Konfluenz von 80–100 % erreicht haben.
- Infizieren Sie die Zellen mit MP-12 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 3. Stellen Sie mindestens zwei nicht infizierte Wells bereit: Eines der beiden Wells dient als nicht infizierter Kontrollansatz, das andere wird mit Actinomycin D (ActD) behandelt. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und verdünnen Sie den Virusstamm so, dass das Gesamtvolumen, das jedem Well zugegeben wird, beträgt 400 μL. 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
- Entfernen Sie das Inokulum und geben Sie 2 mL frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 12 Stunden
HINWEIS: Wenn dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus angepasst wird, empfiehlt es sich, einen Zeitverlaufsversuch durchzuführen, um den optimalen Zeitpunkt für die Markierung und Gewinnung zu bestimmen. Gestalten Sie diesen Zeitverlauf so, dass die Infektionszeiten versetzt sind und alle Proben gleichzeitig markiert, geerntet und gefärbt werden können.
- 12 Stunden nach der Infektion (hpi) ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein Medium, das 0,5 mM EU enthält. Zu einem der mock-infizierten Wells geben Sie zusätzlich 5 μg/mL ActD. Dies dient als Kontrolle für die transkriptionelle Suppression, da ActD die DNA-abhängige RNA-Synthese hemmt. Die Zellen werden anschließend in den Inkubator zurückgebracht.
- 13 Stunden nach der Infektion die Zellen einmal mit gepuffertem Salzlösung (PBS) waschen und durch Trypsinisierung gewinnen. Die gewonnenen Zellen dreimal mit PBS, das 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, waschen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei diesem und den folgenden Schritten eine Zentrifugalkraft von nicht mehr als 500–1.000 × g, um Zellbruch zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Zellen 1–2 Minuten lang, um sie abzusedimentieren.
HINWEIS: Falls nach der Click-Reaktion eine Oberflächen-Immunfärbung geplant ist, verwenden Sie stattdessen einen Gummiputzer oder einen Einweg-Zellkratzer zur Ernte.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 1 mL 4%iger Paraformaldehyd (PFA) resuspendieren, und inkubieren Sie 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Einmal mit 1 mL PBS-EDTA pro Vertiefung waschen. Unmittelbar mit Schritt 2 fortfahren.
HINWEIS: Es ist wichtig, unverzüglich mit der Click-Reaktion fortzufahren, da die RNA zerfällt, wenn sie über längere Zeit in diesem Stadium belassen wird. Ebenso sollten bei einer Zeitreihenuntersuchung alle Proben gleichzeitig markiert, fixiert und gefärbt werden.
Klick-Reaktion zur Detektion markierter RNA
- Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,2 % Triton X-100 in PBS permeabilisieren. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Alle in den Schritten 2.1 bis 2.3 verwendeten Lösungen müssen nukleasefrei sein.
- Dreimal mit je 1 ml PBS pro Gut waschen.
- Entfernen Sie die Deckgläser aus der 12-Loch-Platte und überführen Sie sie in eine feuchte Kammer. Bedecken Sie jedes Deckglas mit 50 - 100 μl Click-Färbungslösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO₄)4, 20 μM fluoreszierendes Azid [Anregungs-/Emissionsmaximum: 590/617 nm], 100 mM Ascorbinsäure). 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
HINWEIS: Um die Feuchtkammer zusammenzubauen, legen Sie den Boden einer Zellkulturschale oder Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm mit einer Plastik-Parafilm-Schicht aus. Legen Sie die Innenseite des Schalenrands mit feuchten Papiertüchern aus. Legen Sie die Deckgläser auf die Plastik-Parafilm-Schicht.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Deckgläser während dieses und aller anderen Schritte des Protokolls nicht austrocknen. Es ist am besten, die Färbungslösung jedem Deckglas unmittelbar nach dem Einlegen in die Feuchtkammer direkt zuzugeben.
HINWEIS: Bereiten Sie die Click-Anfärbungslösung unmittelbar vor diesem Schritt frisch zu. Stammlösungen von 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄4und 500 mM Ascorbinsäure können bei 4 °CVerwerfen Sie jedoch jede Ascorbinsäure-Stammlösung, die gelb geworden ist.
HINWEIS: Achten Sie darauf, einen Fluorophor auszuwählen, der zu den Filtern Ihres Fluoreszenzmikroskops passt.
- Entfernen Sie die Deckgläser aus der feuchten Kammer und geben Sie sie in eine neue 12-Loch-Platte. Spülen Sie dreimal mit jeweils 1 ml PBS pro Loch.
- Deckgläser montieren, indem man einen Tropfen (ca. 15 μl) von Fluoromount-G auf einen Objektträger. Tauchen Sie die Deckglas in H2O, überschüssiges H entfernen2O, indem Sie die Seite an ein Papiertuch anlegen, und platzieren Sie die Zellseite nach unten in den Tropfen Fluoromount-G. Lufttrocknen für 5 min.
HINWEIS: Wenn die Bildgebung an einem inversen Mikroskop durchgeführt wird, Fluoromount-G unter Luftabschluss aushärten lassen 4 °C über Nacht oder befestigen Sie die Deckgläser auf dem Objektträger, indem Sie die Kanten mit durchsichtigem Nagellack versiegeln.
HINWEIS: Die Objektträger können sofort abgebildet oder gelagert werden bei 4 °C im Dunkeln bis zu einer Woche lang
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5-Ethynyluridin | Berry Associates | PY 7563 | In DMSO für 100 mM-Stammlösung auflösen |
| 12-mm-Runddeckgläser | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | In DMSO für 10 mM-Stammlösung auflösen |
| Fluoreszenzmikroskop | z. B. Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | In H₂O für 100 mM-Stammlösung auflösen |
| DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS (fötales Rinderserum) | Invitrogen | 16000044 | |
| Fluoreszierende Azid (mit Alexa Fluor 594 gekoppelt) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A-5960 | In H₂O für 500 mM auflösen |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Trizma-Basis | Sigma | T-1503 | In H₂O für 1,5 M-Stammlösung, pH 8,5, auflösen |
