Analyse der virusinduzierten Suppression der Wirtszelltranskription mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Kalveram, B., et al. Nutzung der Click-Chemie zur Messung der Auswirkung einer Virusinfektion auf die RNA-Synthese in Wirtszellen. J. Vis. Exp. (2013)

In diesem Video wird die Anwendung der Click-Chemie und der Durchflusszytometrie zur Messung der virusinduzierten Hemmung der Wirtszelltranskription demonstriert. Säugetierzellen werden mit einem Virus infiziert, das ein nukleäres Virulenzprotein exprimiert, das den Transkriptionsfaktorkomplex der Wirtszelle stört, während Kontrollzellen weiterhin transkriptionell aktiv bleiben. Die Einlagerung von 5-Ethynyluridin markiert neu synthetisierte mRNA und ermöglicht so die Quantifizierung der transkriptionellen Aktivität in infizierten und Kontrollzellen mittels Detektion der Doppel-Fluoreszenz.

Protokoll

1. Infizieren Sie Zellen mit MP-12 und markieren Sie neusynthetisierte RNA mit 5-Ethynyluridin (EU)

1. Seeden Sie 293-Zellen in eine 6-Loch-Gewebekulturplatte mit Wachstumsmedium (DMEM, das 10% fetalen Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin enthält). Inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂, bis die Zellen 80–100% Konfluenz erreicht haben.
2. Infizieren Sie die Zellen mit MP-12 bei einem Multiplikationsfaktor von 3. Führen Sie mindestens zwei nicht infizierte Wells ein: Eines der beiden Wells dient als nicht infizierter Kontrollansatz, das andere wird im Schritt 1.4 mit ActD behandelt. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und verdünnen Sie den Virusstamm so, dass das Gesamtvolumen, das jedem Well zugegeben wird, 400 μl beträgt. Inkubieren Sie eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂.
3. Entfernen Sie das Inokulum und geben Sie 2 ml frisches Wachstumsmedium pro Well hinzu. Inkubieren Sie 12 Stunden bei 37 °C.

HINWEIS: Falls dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus angepasst wird, empfiehlt es sich, einen Zeitverlaufsversuch durchzuführen, um den optimalen Zeitpunkt für die Markierung und Gewinnung zu bestimmen. Richten Sie diesen Zeitverlauf so ein, dass die Infektionszeiten versetzt sind und alle Proben gleichzeitig markiert, gewonnen und gefärbt werden können.

4. 12 Stunden nach der Infektion das Wachstumsmedium durch ein Medium mit 0,5 mM EU ersetzen. Zu einem der mock-infizierten Gefäße zusätzlich 5 μg/ml ActD hinzufügen. Dies dient als Kontrolle für die transkriptionelle Suppression, da ActD die DNA-abhängige RNA-Synthese hemmt. Die Zellen anschließend in den Inkubator zurückbringen.
5. 13 Stunden nach der Infektion die Zellen einmal mit PBS waschen und durch Trypsinisierung gewinnen. Die gewonnenen Zellen dreimal mit PBS, das 1 mM EDTA enthält (PBS-EDTA), waschen.

HINWEIS: Zentrifugieren Sie die Zellen in diesem und den folgenden Schritten nicht schneller als 500 - 1.000 × g, um Zellbruch zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Zellen 1–2 Minuten lang, um sie abzusedimentieren.

HINWEIS: Falls eine Oberflächen-Immunfärbung im Anschluss an die Click-Reaktion geplant ist, die Zellen stattdessen mit einem Gummipoliceman oder einem Einweg-Zellabstreifer gewinnen.

6. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 1 ml 4 % PFA resuspendieren, und inkubieren Sie 30 min bei RT.
7. Waschen Sie einmal mit 1 ml PBS-EDTA pro Vertiefung. Fahren Sie unmittelbar mit Schritt 6 fort.

HINWEIS: Es ist wichtig, unverzüglich mit der Click-Reaktion fortzufahren, da die RNA zerfällt, wenn sie über längere Zeiträume in diesem Stadium aufbewahrt wird. Ebenso sollten bei einem Zeitverlaufsversuch alle Proben gleichzeitig markiert, fixiert und gefärbt werden.

2. Klick-Reaktion zur Detektion markierter RNA

1. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 0,5 ml 0,2 %iger Triton X-100-Lösung in PBS resuspendieren. Inkubieren Sie 10 min bei RT.

HINWEIS: Alle Lösungen, die in den Schritten 2.1 bis 2.3 verwendet werden, müssen nukleasefrei sein. Falls die Zellen in diesem Schritt nicht ordnungsgemäß sedimentieren, verlängern Sie die Zentrifugationszeit auf 5 min. Das Sedimentationsverhalten wird sich verbessern, sobald die Zellen in dem FACS-Puffer suspendiert sind.

2. Einmal mit 1 ml PBS waschen.

HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Schritt kein EDTA, da dies die für die Click-Reaktion notwendigen Cu²⁺-Ionen chelatisiert.

3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Click-Färbungslösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200 nM Azid, markiert mit einem fluoreszierenden Farbstoff [Anregungs-/Emissionsmaximum: 650/665 nm], 100 mM Ascorbinsäure). Inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.

HINWEIS: Bereiten Sie die Click-Färbungslösung unmittelbar vor diesem Schritt frisch zu. Stammlösungen von 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄ und 500 mM Ascorbinsäure können bei 4 °C aufbewahrt werden. Verwerfen Sie jedoch jede Ascorbinsäure-Stammlösung, die gelb geworden ist. Falls die Zellen in diesem Schritt zusammenklumpen, lösen Sie sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren erneut auf. Achten Sie darauf, einen Fluorophor auszuwählen, der von Ihrem Durchflusszytometer detektiert werden kann. Bereiten Sie außerdem eine Probe infizierter Zellen vor, die nicht der Click-Färbung unterzogen wird; diese wird zur Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt. Verwenden Sie entweder die Hälfte der infizierten Zellen oder fügen Sie eine zusätzliche infizierte Vertiefung im Schritt 1,2 hinzu.

Zweimal mit FACS-Puffer (PBS mit 1 mM EDTA und 0,5 % (w/v) BSA) waschen.

3. Immunfluoreszenz zum Nachweis der Expression viraler Proteine

1. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Primärantikörper (anti-RVFV), verdünnt in FACS-Puffer (1:10.000), und inkubieren Sie 1 Stunde bei RT im Dunkeln.

HINWEIS: Alternativ kann dieser Schritt O/N bei 4 °C im Dunkeln durchgeführt werden.

HINWEIS: Bereiten Sie außerdem eine Probe uninfizierter Zellen vor, die dem Click-Färbeprozess unterzogen wurden, jedoch nicht immunfärbegestützt werden; diese werden zur Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt. Verwenden Sie entweder die Hälfte der mock-infizierten Zellen oder fügen Sie einen zusätzlichen uninfizierten Wellschritt bei Schritt 1.2 hinzu.

HINWEIS: Wenn Sie dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus anpassen, ermitteln Sie zuerst die optimale Verdünnung Ihres Primärantikörpers.

2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit FACS-Puffer.
3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl sekundärem Antikörper (anti-maus IgG, konjugiert mit einem fluoreszierenden Farbstoff [Absorptions-/Emissionsmaximum: 495/519 nm]), verdünnt im FACS-Puffer (1:1.000), und inkubieren Sie 1 Stunde bei RT im Dunkeln.
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer.

HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen über Nacht bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-Ethynyl-uridin	Berry Associates	PY 7563	in DMSO für 100 mM-Stammlösung auflösen
12-mm-runde Deckgläser	Fisherbrand	12-545-82
5-ml-Polystyrolröhrchen	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	in DMSO für 10 mM-Stammlösung auflösen
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG	Invitrogen	A-11029
Rinderserumalbumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	in H2O für 100 mM-Stammlösung auflösen
DAPI	Sigma	D-9542	in H2O für 5 mg/ml-Stammlösung auflösen
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluoreszierendes Azid (mit Alexa Fluor 594 gekoppelt)	Invitrogen	A10270
fluoreszierendes Azid (mit Alexa Fluor 657 gekoppelt)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-Ascorbinsäure	Sigma	A-5960	in H2O für 500 mM auflösen
Papierfilter	VWRbrand	28333-087
Paraformaldehyd	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Poly-L-lysin (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma-Basis	Sigma	T-1503	in H2O für 1,5 M-Stammlösung, pH 8,5 auflösen
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluoreszenzmikroskop			z. B. Olympus IX71
Durchflusszytometer			z. B. BD Biosciences LSRII Fortessa