Herstellung von retroviralen Partikeln für den Gentransfer

Zusammenfassung

Quelle: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation und Differenzierung muriner myeloischer Vorläuferzellen 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Herstellung rekombinanter retroviraler Partikel durch die Transfektion menschlicher, aus Niere stammender Verpackungszellen, die eine stabile Genübertragung in Zielzellen für nachgeschaltete Anwendungen wie genetische Modifikation, Funktionsanalysen oder Studien zur Linien-Differenzierung ermöglicht.

Protokoll

1. Herstellung von Retroviren
   1. Pipettieren Sie eine Einzelzell-Suspension von Bosc23-Zellen (6 × 10⁶) in eine 16 cm Petrischale und kultivieren Sie sie in 18 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit 10 % FBS (fetal bovine serum), bis die Konfluenz der Kultur 80 % erreicht (24 h).
      HINWEIS: Die Zellen sollten als Monolayer wachsen und im Kulturmedium keine Klumpen bilden. Die Zellzählung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden (gültig für alle hier vorgestellten Protokolle). Bei einer geringen Anzahl von Proben wird die manuelle Zählung unter dem Mikroskop mit einer Bürker-Kammer empfohlen. Verwenden Sie in diesem Fall Trypanblau zur Ausschließung toter Zellen. Mischen Sie die Zellen 1:1 mit 0,4 % Trypanblau in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Für die Zählung einer großen Anzahl von Proben kann ein automatischer Zellzähler verwendet werden.
   2. Vermischen Sie 40 µg retroviralen Konstrukt (z. B. MSCV), 20 µg pCL-Eco (Verpackungsvektor), 80 µl PEI (Polyethylenimin) und 2 mL Medium mit reduziertem Serumgehalt (z. B. Opti-MEM (Minimum Essential Medium) (ohne Antibiotika). Inkubieren Sie diese Mischung 20 min bei Raumtemperatur (RT).
   3. Ersetzen Sie das Medium der Bosc23-Zellen vorsichtig durch 16 mL DMEM, ergänzt mit 2 % FBS. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 °C.
      HINWEIS: Verwenden Sie während der Transfektion keine Antibiotika, da diese die Transfektionseffizienz verringern können.
   4. Geben Sie die in Schritt 1.2 hergestellte Mischung tropfenweise und vorsichtig in die Bosc23-Kultur und inkubieren Sie 4 h bei 37 °C. Begrenzen Sie die Inkubation auf weniger als 6 h aufgrund der Toxizität von PEI.
   5. Wechseln Sie nach der Inkubation das Medium der Bosc23-Zellen zu 18 mL vorgewärmtem DMEM mit 10 % FBS und kultivieren Sie die Zellen 48 h bei 37 °C. Stellen Sie die Schalen in ein Labor der Biosicherheitsstufe 2 und befolgen Sie die standardmäßigen Sicherheitsvorschriften.
   6. Sammeln Sie das Bosc23-Medium (enthält ekotrope retrovirale Partikel) mit einer 25-mL-Serologischen Pipette in einem 50-mL-Konischgefäß und lagern Sie es bei 4 °C.
      HINWEIS: (Wichtig) Die Transfektionseffizienz sollte 90 % erreichen, um ein Virus mit hoher Titer zu erzeugen.
   7. Fügen Sie 18 mL vorgewärmtes DMEM mit 10 % FBS zu den Bosc23-Zellen hinzu und kultivieren Sie 24 h.
   8. Wiederholen Sie Schritt 1.6.
      HINWEIS: Retrovirale Überstände aus 1.6 und 1.8 können vereinigt werden, sobald sie die gleiche Temperatur erreicht haben (4 °C), um die Integrität der Viren zu bewahren.
   9. Um Kontaminationen mit Bosc23-Zellen in den viralen Überständen zu vermeiden, zentrifugieren Sie das gesammelte Virus 10 min bei 1500 × g und 4 °C. Portionieren Sie das Virus, schockgefrieren Sie es mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C. Beachten Sie jedoch, dass frisch hergestelltes Virus hinsichtlich der Infektionseffizienz eine höhere Qualität aufweist als eingefrorene Vorräte.
      HINWEIS: (Wichtig) Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus, da dies zu einer viralen Degradation führt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Medium mit reduziertem Serumgehalt	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamin, Phenolrot
Fetales Kälberserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Verwendung zur Kultivierung von HEK293T-, NIH3T3- und BOSC23-Zellen
Penicillin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomycin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomycinsulfatsalzpulver
Gentamicin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polyethylenimin	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Linear, MW 25.000 (PEI 25000)