Generierung eines GFP-markierten rekombinanten Respiratorischen Synzytial-Virus unter Verwendung eines T7-Expressionssystems

Zusammenfassung

Quelle: Bouillier, C. et. al., Amplifikation und Titration rekombinanter humaner Respiratorischer Synzytialviren. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Erzeugung eines rekombinanten respiratorischen Synzytialvirus, das ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, mithilfe eines auf T7 basierenden Reverse-Genetik-Systems. Die Cotransfektion von Plasmiden, die virale Proteine und ein GFP-markiertes Genom kodieren, führt zur Proteinexpression und initiiert die Virusrescue.

Protokoll

1. Rekonstitution und erste Passage des rekombinanten Virus

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Sicherheitswerksatzes der Klasse II durch.

1. Am Tag vor der Transfektion stellen Sie eine Suspension der BSRT7/5-Zelllinie in vollständigem Medium mit einer Konzentration von 5 x 10⁵ Zellen/mL her. Geben Sie 2 mL der Zellsuspension pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte. Bereiten Sie je eine Vertiefung pro zu rettendem Virus sowie eine zusätzliche Vertiefung als negativen Kontrollansatz vor. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂. Überprüfen Sie am nächsten Tag, ob die Zellen eine Konfluenz von 80–90 % erreicht haben.
2. Tauen Sie die Reverse-Genetik-Vektoren des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) p-RSV-GFP und p-RSV-M2-1-GFP sowie p-N, p-P, p-L und p-M2-1 auf. Mischen Sie für jedes zu rettende Virus 1 µg p-N und p-P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 und 1,25 µg p-RSV (GFP oder M2-1-GFP) in einem Reaktionsgefäß.
   HINWEIS: Es können unterschiedliche Expressionsvektoren für die viralen Proteine des Polymerasekomplexes (N, P, L und M2-1) verwendet werden; das Verhältnis zwischen den Proteinen muss jedoch beibehalten werden. Führen Sie die negative Kontrolle durch Ersetzen des p-RSV-Vektors durch einen leeren Vektor durch.
3. Führen Sie die Transfektion durch (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Geben Sie 250 µL Medium mit reduziertem Serumanteil zu den gemischten Vektoren. Verdünnen Sie in einem weiteren Reaktionsgefäß 10 µL des Transfektionsreagenzes in 250 µL Medium mit reduziertem Serumanteil. Vortexen Sie beide Reaktionsgefäße vorsichtig und warten Sie 5 Minuten. Mischen Sie die Inhalte beider Gefäße und lassen Sie die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Spülen Sie die BSRT7/5-Zellen mit 1 mL Medium mit reduziertem Serumanteil aus und geben Sie 1,5 mL Minimal Essential Medium (MEM) mit 10 % Fetalcalf-Serum (FCS), ohne Antibiotika, pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie gegebenenfalls bei 37 °C und 5 % CO₂, bis die in Schritt 1.3.1 beschriebene Inkubationszeit abgeschlossen ist.
   3. Geben Sie nach Ablauf der 20-minütigen Inkubationszeit 500 µL der in Schritt 1.3.1 hergestellten Transfektionsmischung in eine Vertiefung. Stellen Sie die Zellen für 3 Tage in den Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂. Wechseln Sie das Kulturmedium während der Transfektion nicht.
4. Beobachten Sie einmal täglich die Fluoreszenz des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) (Anregung bei 488 nm, Emission bei 515–535 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um die Rettungseffizienz mithilfe des GFP-Filters zu überwachen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BSRT7/5		nicht kommerziell erhältlich	Siehe Referenz 22. Buchholz et al. 1999
Fluoreszenzmikroskop für Beobachtungen	Olympus	IX73 Olympus Mikroskop
Fluoreszenzmikroskop für Videomikroskopie	Olympus	ScanR Olympus Mikroskop
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5 %	Sigma	H3375
L-Glutamin (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Lipofactamin 2000 Reagenz	ThermoFisher Scientific	11668019	Das Protokoll in Schritt 2.3. ist auf dieses Reagenz optimiert.
MEM (10x), ohne Glutamin	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX-Zusatz	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagenzPlus, ≥99,5 %	Sigma	M7506
Opti-MEM I reduziertes Serummedium	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plasmide		nicht kommerziell erhältlich	Siehe Referenz 21. Rameix-Welti et al. 2014