Plaque-Titrations-Assay zur Quantifizierung von infektiösen Respiratorischen Synzytial-Viren

Zusammenfassung

Quelle: Bouillier, C., et al. Erzeugung, Amplifizierung und Titration rekombinanter respiratorischer Synzytialviren. J. Vis. Exp. (2019)

Das Video demonstriert einen Plaque-Titrationsassay, der zur Quantifizierung infektiöser rekombinanter respiratorischer Synzytialviren (RSV) in epitelialen Zellmonolagen verwendet wird. Es zeigt die Infektion von Wirtszellen mit seriell verdünnten viralen Suspensionen, die Einschränkung der Virusausbreitung durch eine zellulosebasierte halbfeste Überlagerung und die Bildung lokalisierter Plaques infolge zytopathischer Effekte. Das Verfahren schließt mit Färbung, Dekontamination und Plaque-Zählung ab, um die virale Titerkonzentration zu bestimmen und die RSV-Infektiösität zu bewerten.

Protokoll

1. Plaque-Titerbestimmung

1. Bereiten Sie die 12-Loch-Platten für die Titration am Tag vor der Durchführung des Titrationstests vor (für die Titration eines Virusgefäßes werden sechs Löcher benötigt). Säen Sie die Löcher mit 1 mL menschlichen epithelialen Zellen Typ-2 (HEp-2) bei 5 × 10⁵ Zellen/mL in komplettem Medium.
2. Am nächsten Tag bereiten Sie eine sterile mikrokristalline Cellulosesuspension (2,4 % [m/V] in Wasser) vor (siehe Tabelle der Materialien).
   1. 2,4 g mikrokristallines Cellulosepulver in 100 mL destilliertem Wasser unter Verwendung eines standardmäßigen magnetischen Rührers dispergieren, bis das Pulver vollständig gelöst ist (gewöhnlich 4–12 h). Die Suspension im Autoklaven sterilisieren bei 121 °C 20 min lang und lagern Sie es vor der Verwendung bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen ist die Suspension 1 Jahr lang stabil.
   2. Nach dem Öffnen der Lösung in einer sterilen Umgebung bei 4 °C sechs Monate. Die Suspension vor der Anwendung stets mischen (durch Schütteln per Hand oder Vortexen), um eine homogene Verteilung sicherzustellen.
3. Bereiten Sie die 2× minimales essentielles Medium (MEM) in einer sterilen Umgebung. Verdünnen Sie handelsübliches MEM 10-fach× mit steriler Wasser und fügen Sie L-Glutamin, 1.000 Einheiten/mL Penicillin und 1 mg/mL Streptomycin hinzu. Schütteln Sie die Verdünnung kräftig und lagern Sie sie bei 4 °C.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.4–1.10 unter sterilen Bedingungen in einem Sicherheitswerkbank der Klasse II durch.
4. Bereiten Sie sechs Reagenzröhrchen vor, die enthalten 900 µL von MEM ohne fetalen Kälberserum (FCS) pro zu titrierendes Virus (die Titrierrohre). Die Virusaliquote auftauen, 5 s kräftig verwirbeln und übertragen 100 µL in das erste Titrierrohr.
5. Führen Sie eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 durch×, wie folgt. Hinzufügen 100 μL des Virus zu 900 μL des Mediums in das erste Reagenzglas, setzen Sie den Verschluss auf das Reagenzglas und mischen Sie den Inhalt durch Vortexen für einige Sekunden. Wechseln Sie die Pipettenspitze, fügen Sie hinzu 100 µL der ersten Verdünnung zu 900 µL des Mediums in das zweite Reagenzglas, verschließen Sie das Reagenzglas und wirbeln Sie es gründlich. Wiederholen Sie den Vorgang bis zum sechsten Reagenzglas.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, bei jeder Verdünnung die Pipettenspitze zu wechseln.
6. Schreiben Sie den Virennamen und die Verdünnungsstufen auf die HEp-2-12-Well-Platten. Kennzeichnen Sie die Platte und ihren Deckel entsprechend, da sie während der Färbung (Schritt 1.9) getrennt werden können. Entfernen Sie das Medium von den Platten und verteilen Sie 400 µL einer Verdünnung pro Mulde. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 2 h zur Virusadsorption.
   HINWEIS: Wechseln Sie die Pipettenspitze zwischen jedem Inokulum oder arbeiten Sie mit derselben Spitze von der niedrigsten zur höchsten Konzentration. Inokulieren Sie gleichzeitig nur eine begrenzte Anzahl von Platten (1 bis 2), um das Austrocknen der Zellen zu vermeiden.
7. Bereiten Sie die Mikrokristallcellulose-Überlagerung während der Virusadsorption frisch zu (extemporane Zubereitung). Für 100 mL Überlagerung mischen Sie 10 mL einer 2,4%igen Mikrokristallcellulose-Suspension, 10 mL einer 2× MEM und 80 mL MEM mit 2 % FCS.
   1. Stellen Sie den pH-Wert des 2× MEM mit einer sterilen Natriumbicarbonat-Lösung (7,5 %) auf einen pH-Wert von etwa 7,2 einstellen, basierend auf dem Farbindikator. Die Mikrokristallin-Cellulose-Suspension zu dem MEM hinzufügen und gründlich mischen.
8. Am Ende der 2-stündigen Inkubation 2 bis 3 mL Überlagerungsmittel zu jedem Brunnen der 12-Loch-Platten hinzufügen, ohne das Inokulum zu entfernen. Dabei vorsichtig vorgehen, um eine Kontamination benachbarter Brunnen mit Inokulaten hoher Viruslast zu vermeiden. Die Platte inkubieren bei 37 °C und 5 % CO₂ sechs Tage lang. Während der Inkubation die Platte und den Inkubator nicht bewegen.
9. Färben Sie die Zellen mit einer Kristallviolett-Lösung (8 % Kristallviolett [v/v], 2 % Formaldehyd [v/v] und 20 % Ethanol [v/v] in Wasser).
   1. Schützen Sie die Arbeitsfläche des Sicherheitswerkbanks mit einem Blatt (das Kristallviolett färbt Oberflächen stark).
   2. Vorsichtig die Platten schütteln, um die Mikrokristallcellulose-Überlagerung zu entfernen. Den Überstand abnehmen und die Zellen 2-mal waschen× mit 1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Behandeln Sie die Platten einzeln, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden. Geben Sie 1–2 mL der Kristallviolett-Lösung hinzu und warten Sie 10–15 Minuten. Entfernen Sie die Lösung, die für nachfolgende Färbungen wiederverwendet werden kann.
   3. Tauchen Sie die Platten und Deckel für einige Sekunden in frische Bleichlösung ein und spülen Sie sie anschließend gründlich mit Leitungswasser ab. Beachten Sie, dass die Platten und Deckel durch die Bleichlösung entkeimt werden.
   4. Stellen Sie die Platten und Deckel auf Papierhandtücher und lassen Sie sie trocknen. Trocknen Sie die Platten nach dem Spülen mit Wasser bei Raumtemperatur und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Bei längerer Lagerung (Monate) sollten die Platten vor Licht geschützt werden, um die Farbe zu bewahren. Beachten Sie, dass die Zellen bei Farbverlust erneut mit Kristallviolett angefärbt werden können.
10. Berechnen Sie die Virentitrierungen. Zählen Sie die Plaques in den Vertiefungen der trockenen Platten, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Überprüfen Sie, ob die Anzahl der Plaques der verschiedenen Verdünnungen konsistent ist (Faktor 10 zwischen jeder Verdünnung). Wählen Sie die Vertiefung aus, in der die Plaques am einfachsten zu zählen sind. Ermitteln Sie die Anzahl der Plaques in Bezug auf das Inokulumvolumen und die Verdünnung.
    HINWEIS: Am Beispiel, das bereitgestellt wurde in Abbildung 1, werden 21 Plaques in der 10^-5 Verdünnung. Dies entspricht einem Titer von

Ergebnisse

Abbildung 1: Bestimmung der RSV-Titer mittels Plaque-Assay. (A) Ergebnisse des Plaque-Titrierassays in einer 12-Loch-Platte. Die sechs mit seriellen Verdünnungen einer Virusstammlösung infizierten Löcher sind dargestellt. Die Verdünnungen sind in Basis-10-Logarithmus angegeben. Alle Zellen, die mit den drei ersten Verdünnungen infiziert wurden, haben sich gelöst. Die Anzahl der beobachteten Plaques bei den Verdünnungen 10^-4, 10^-5 und 10^-6 ist konsistent. (B) Veranschaulichung der Plaque-Zählung (gelbe Zahlen). Der grüne Stern markiert Kratzer in der Zellschicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kristallviolett-Lösung	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), ohne Glutamin	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX-Zusatz	ThermoFisher Scientific	41090-028
Natriumbicarbonat 7,5 %ige Lösung	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122