Bestimmung der viralen Replikationskapazität mittels eines radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assays

Zusammenfassung

Quelle: Claiborne, D. T. et al. Eine Restriktionsenzym-basierte Klonierungsmethode zur Beurteilung der In-vitro-Replikationskapazität von HIV-1-Subtyp-C-Gag-MJ4-chimären Viren. J. Vis. Exp. (2014)

In diesem Video wird die Beurteilung der viralen Replikationskapazität mithilfe eines radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assays gezeigt. Kulturüberstände, die Nachkommaviren enthalten, werden einer Reverse-Transkriptionsmischung mit einem radioaktiv markierten Nukleotid zugesetzt. Das eingebaute Signal spiegelt die virale Ausbeute und Replikationseffizienz wider. Mithilfe der Phosphorabbildung werden Signale zwischen Test- und Wildtyp-Proben detektiert und verglichen.

Protokoll

1. Analyse der Reverse Transkriptase (RT) in Zellkulturüberständen

1. Richten Sie eine biologische Sicherheitswerkbank in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) für die Verwendung mit radioaktiven Materialien ein.
   1. Legen Sie absorbierendes Papier in die Werkbank und ersetzen Sie den Aspirator durch einen für den Einsatz mit radioaktiven Stoffen vorgesehenen Aspirator. 
      HINWEIS: Alle radioaktiven Abfälle müssen gemäß den Sicherheitsvorschriften ordnungsgemäß entsorgt werden.
2. Geben Sie 1–2 µl von 10 mCi/ml [α-³³P]-Desoxythymidintriphosphat (dTTP) und 4 µl von 1 M Dithiothreitol (DTT) zu jedem 1-ml-Aliquot der RT-Master-Mischung hinzu (siehe Tabelle 1).
3. Mischen Sie vorsichtig jedes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit RT-Master-Mischung, DTT und [α-³³P] dTTP mit einer 1.000-µl-Pipette und überführen Sie die Mischung in einen sterilen Vorratsbehälter.
4. Geben Sie jeweils 25 µl der markierten RT-Mischung in jedes Loch einer 96-Loch-dünnwandigen Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Platte. 
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie Plätze für eine positive Kontrolle (Infektion mit MJ4-Wildtyp (WT)) und eine negative Kontrolle (Scheininfektion).
5. Geben Sie jeweils 5 µl des Überstandes zur PCR-Platte mit der RT-Master-Mischung hinzu.
6. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einer selbstklebenden Folie und inkubieren Sie sie 2 Stunden bei 37 °C in einem Thermocycler. Aus Sicherheitsgründen spülen Sie die Pipettenspitzen mit Amphyl ab und entsorgen Sie sie in einem kleinen Behälter mit Amphyl-Abfall, der später als radioaktiver Abfall entsorgt wird.
7. Stechen Sie nach der Inkubation mit einer 200-µl-Mehrkanalpipette kleine Löcher in die Folienabdeckung. 
   HINWEIS: Falls die Pipettenspitzen die Flüssigkeit im Loch berühren, ersetzen Sie die Spitzen, bevor Sie zur nächsten Spalte oder Reihe wechseln.
8. Mischen Sie die Proben 5-mal und überführen Sie jeweils 5 µl jeder Probe auf DE-81-Papier. Trocknen Sie 10 Minuten an der Luft.
9. Waschen Sie die Blots 5-mal mit 1x Salz-Natriumcitrat (SSC) und anschließend 2-mal mit 90 %igem Ethanol, jeweils 5 Minuten pro Waschgang. Lassen Sie sie an der Luft trocknen.
   1. Legen Sie jeden Blot in einen separaten Waschbehälter, beispielsweise eine Brotdosenbox, geben Sie ausreichend Waschpuffer (1x SSC oder 90 %igen Ethanol (EtOH)) hinzu, um den Blot zu bedecken, und schütteln Sie 5 Minuten lang.
   2. Gießen Sie den Waschpuffer in einen separaten Behälter ab und wiederholen Sie den Vorgang. HINWEIS: Die ersten 3 Waschungen gelten als radioaktiv und müssen ordnungsgemäß entsorgt werden. Die letzten 2 Waschungen können regulär entsorgt werden.
10. Wickeln Sie den getrockneten Blot vorsichtig in Frischhaltefolie ein und belichten Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Phosphoscreen in einer dicht verschlossenen Kassette.
11. Analysieren Sie die Phosphoscreens mit einem Phosphorimager und quantifizieren Sie die radioaktiven Transkripte.
12. Zeichnen Sie mit der OptiQuant-Software einen Kreis um jedes radioaktive Signal. Tragen Sie die Digital Light Unit (DLU)-Werte grafisch auf, um Replikationskurven zu erstellen.
13. Um Replikationskapazitäts-Scores zu berechnen, wurden die DLU-Werte log₁₀-transformiert, und die Steigungen wurden anhand der Zeitpunkte Tag 2, 4 und 6 berechnet. Die Replikationssteigungen wurden anschließend durch die Steigung von WT MJ4 dividiert, um die Replikationskapazitäts-Scores zu erhalten. Es ist wichtig, anhand der aus derselben RT-Platte erhaltenen MJ4-WT-Werte zu normalisieren, um die Variabilität innerhalb des Assays zu verringern.

Tabelle 1: Rezeptur für den Mastermix des radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assays.
HINWEIS: In Aliquots zu je 1 ml bei -20 °C lagern.

Reagenz	Volumen (ml)
Nukleasefreies H2O	419.5
Tris-Cl, pH 7,8 (1 M)	30
Kaliumchlorid (1 M)	37,5
Magnesiumchlorid (1 M)	2,5
Nonidet P-40 (10 %)	5
EDTA (0,5 M)	1,02
Polyadenylsäure, Kaliumsalz (2 mg/ml)	1,25
Oligo-dT-Primer (25 μg/ml)	3,25
Gesamtvolumen	500

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur-Reagenzien
Amphyl-Reiniger/Desinfektionsmittel	Fisher	22-030-394
Reservoirtrays für Multikanal, 55 ml	Fisher	13-681-501
1 M Magnesiumchloridlösung	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reagenzien für die Reverse-Transkriptase-Quantifizierungsanalyse
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8,0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Muss mit KOH auf pH 7,8 eingestellt werden
2 M Kaliumchlorid (KCl)	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Auf 1 M Lösung verdünnen
0,5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Polyadenylsäure (Poly rA), Kaliumsalz	Midland Reagent Co.	P-3001
Oligo d(T)-Primer	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, Phosphorschirm mit Super-Auflösung, klein	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell 96-Well-Platte Modell (M) Polycarbonat	Fisher	07-200-245	Von Corning Life hergestellt
Corning 96-Well-Mikroplatten-Aluminiumversiegelungsfolie, nicht steril	Fisher	07-200-684	Von Corning Life hergestellt
DE-81-Anionenaustauschpapier	Whatman	3658-915
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Natriumchlorid	Fisher	S671-3
Autoradiographiekassette	Fisher	FB-CA-810
Cyclone-Speicherphosphorschirm	Packard
Thermocycler, PTC-200	MJ Research