Probenvorbereitung für die Luziferase-basierte virale Quantifizierung

Zusammenfassung

Quelle: Garcia, V., et al. Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Dieses Video zeigt die Vorbereitung von Zellkulturproben zur Bestimmung der Viruslast mithilfe eines auf Luciferase basierenden Assays. Es erläutert den Prozess der Infektion epithelialer Zellen mit einem genetisch veränderten Virus, das Übertragen von viralen Überständen und Standards in die Assay-Vertiefungen sowie die Förderung des viralen Eintrags durch Zentrifugation und Inkubation. Die Expression von Luciferase dient als Reporter und ermöglicht die Quantifizierung der Viruskonzentration anhand des lumineszenten Signals.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Entnehmen Sie Proben, die ein Luciferase exprimierendes Virus enthalten (im Folgenden beispielhaft VSV∆51-Fluc), zur Titrierung und überführen Sie diese in 96-Loch-Platten. Alternativ können Infektionen in 96-Loch-Zellkulturplatten durchgeführt und die Überstände direkt verwendet werden.
2. Lassen Sie zwei Spalten unbehandelt, um Standardkurven aufzunehmen. Bei Experimenten, die direkt in 96-Loch-Platten durchgeführt werden, bestimmen Sie den Titer am Ende des Experiments (40 Stunden nach der Infektion) oder lagern Sie die Proben bei -80 °C und titrieren Sie zu einem späteren Zeitpunkt.

2. Vorbereitung permissiver Zellen zur Virus-Titration

1. 24 Stunden vor der Titrierung bereiten Sie eine Suspension von Vero-Zellen in einer Konzentration von 2,5 x 10⁵ Zellen/ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10 % fetalen Kälberserum (FBS), 30 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält, vor. 
   HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll Vero-Zellen verwendet, könnte jede geeignete permissive Zelllinie für die Infektion mit Vesikulärer Stomatitis-Virus (VSV) verwendet werden.
2. Säen Sie 2,5 x 10⁴ Zellen (100 μl) in 96-Loch-Weiß-Platten mit flachem Boden unter Verwendung eines Mikroplatten-Dispensers.
   1. Bereiten Sie 12 ml Zellsuspension pro Platte sowie zusätzlich 5 ml zum Anspülen vor.
   2. Reinigen Sie die Kassette des Mikroplatten-Dispensers, indem Sie die Schläuche mit 50 ml steriler Wasser durchspülen.
   3. Füllen Sie die Dispenserleitungen mit der Zellsuspension und lassen Sie 5 ml Zellsuspension durchlaufen.
   4. Wählen Sie ein Programm, das 100 μl in jedes Loch einer weiß-wandigen 96-Loch-Platte abgibt. Geben Sie die Suspension ab und wiederholen Sie dies bei Bedarf für zusätzliche Platten. Säen Sie außerdem einige Löcher in einer 96-Loch-Platte mit klarem flachem Boden an, falls Platten mit undurchsichtigem Boden und weißen Wänden zur Überprüfung der Zellgesundheit und -dichte verwendet werden.
   5. Spülen Sie nach Beendigung die Zellen zurück in den ursprünglichen Behälter. Reinigen Sie die Kassette, indem Sie 50 ml 70 %igen Ethanol, gefolgt von 50 ml warmem sterilem Wasser, durch die Schläuche laufen lassen.
   6. Stellen Sie sicher, dass Kassette und Schläuche zwischen den Anwendungen ordnungsgemäß gereinigt werden.
3. Incubieren Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator.

3. Herstellung der viralen Standardkurve

1. Stellen Sie eine Standardkurve von VSV∆51-Fluc in serumfreiem DMEM her, sodass die endgültige Konzentration an Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml nach der Übertragung auf Vero-Zellen wie folgt lautet: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml und 10¹ pfu/ml. Bereiten Sie 50 μl jeder Konzentration pro Platte mit Vero-Zellen sowie zusätzlich 10 % vor.
   HINWEIS: Die Titrierung des Luciferase-Virusstamms muss klassisch bestimmt werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die eine absolute Quantifizierung ermöglicht. Andernfalls kann eine relative Quantifizierung ohne exakte Titerinformationen erreicht werden, indem der virale Titer willkürlich basierend auf Verdünnungsschritten festgelegt wird. Beispielsweise kann die erste Verdünnung der Standardkurve auf 10⁸ virale Einheiten gesetzt werden, die folgende 1:10-Verdünnung auf 10⁷ usw. In diesem Fall sollten die Werte als Faltungsänderung im Vergleich zu einer vorbestimmten Probe angegeben werden, da die absolute Quantifizierung nicht genau sein wird.

4. Übertragung der Probenüberstände auf permissive Zellen

1. Überprüfen Sie die in der 96-Well-Platte mit klarem Boden ausgesäten Vero-Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Monolagen mindestens zu 95 % konfluent sind.
2. Geben Sie 25 µl der Probenüberstände auf die in Weiß-wand-Platten ausgesäten Vero-Zellen. Überführen Sie keine Überstände in die beiden Spalten, die für die Standardkurven vorgesehen sind. 
   HINWEIS: Dies kann mithilfe eines 96-Kanal-Flüssigkeitsmanipulators gleichzeitig für alle Vertiefungen einer einzelnen Platte durchgeführt werden.
3. Fügen Sie mit einem 8- oder 12-Kanal-Mehrkanalpipettierer jeweils 25 µl jeder Verdünnung der in Schritt 3 hergestellten Standardkurve den Vero-Zellen in den beiden vorgesehenen Spalten hinzu.
4. Zentrifugieren Sie die Platten 5 min bei 430 × g bei Raumtemperatur (RT).
5. Inkubieren Sie 5 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten 5 %igen CO₂-Inkubator.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetales Rinderserum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Eine 1 mM Lösung, pH 7,3, herstellen
96-Well-Platten aus weißem Polystyrol mit festem flachem Boden, TC-behandelt	Corning	3917	384-Well-Platten können ebenfalls für eine höhere Durchsatzleistung verwendet werden
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator-Mikroplattenreader
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Manuelles Pipettiersystem mit 96 Kanälen
Liquidator96 LTS-Spitzen, sterilisiert mit Filtern	Mettler Toledo	LQR-200F	Jede sterilen, gefilterten Spitzen, die mit den gewählten Pipettoren kompatibel sind, sind geeignet
Microflo	BioTek	111-206-21	Wird zum Bebrüten von Zellen in einer 96-Well-Platte verwendet
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Mikroplatten-Fluorometer