Herstellung von Lentivirus-infizierten embryonalen Mausstammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Chiarella, A. M. et. al., Gen-Transkription durch Umleitung der zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetischen Modifikatoren unterdrücken. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Erzeugung genetisch veränderter embryonaler Mausstammzellen mittels lentiviraler Transduktion. Lentivirale Partikel übertragen ein Antibiotikaresistenzmarker-Gen, das eine stabile genomische Integration und die Selektion transduzierter Zellen ermöglicht.

Protokoll

1. Infektion von murinen embryonalen Stammzellen (mESZ) mit Lentivirus

1. Züchten Sie niedrigpassagierte (weniger als Passage 35), ohne Futterzellen adaptierte mESCs für den Chromatin-in-vivo-Assay (CiA) in einem Basalmedium aus hochglukosehaltigem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 20 % ESC-qualitativem fetalem Kälberserum (FBS), 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x nicht essentiellen Aminosäuren (NEAA), Pen/Strep, 2-Mercaptoethanol und 1:500 Leukämie-Inhibitor-Faktor (LIF) ergänzt wurde, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   HINWEIS: Der LIF wird aus dem Überstand von Lif-1C-alpha-produzierenden Cos-Zellen (COS LIF) gewonnen, der in Chargen gesammelt und bei -80 °C eingefroren wird.
   1. Züchten Sie die Zellen auf Platten, die zuvor 1–3 h mit 0,1 % Gelatine in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vorinkubiert und anschließend mit 1x PBS gewaschen wurden. Versorgen Sie die Zellen täglich mit frischem Medium und teilen Sie sie alle 2–3 Tage je nach Dichte auf.
      HINWEIS: Morphologisch sollten Embryonalstammzell-(ES-)Kolonien klein, rund und klar voneinander abgegrenzt sein.
2. Passagieren Sie mESCs einen Tag vor der Infektion in ein 12-Loch-Plattenformat (100.000 Zellen/Loch).
   1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Bei Zellen, die in einem 10-cm-Format gezüchtet wurden, saugen Sie das alte Medium ab, geben 5 mL 1x PBS hinzu, saugen das PBS wieder ab und fügen 1 mL 0,25 % Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 8 min bei 37 °C im Trypsin, wobei Sie die Zellen zur Hälfte der Inkubationszeit vorsichtig schütteln und antippen. Ziel dieses Schritts ist es, die Zellen vollständig in eine Einzelzell-Suspension zu überführen.
3. 48 h nach dem Mediumwechsel der 293T-Human-Embryonal-Nieren-(HEK-)Zellen aus der 15-cm-Platte, entfernen und überführen Sie den Überstand in einen 50-mL-Konustube.
4. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 x g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren.
5. Filtern Sie den Überstand durch eine 0,45-µm-Membran.
   HINWEIS: Verwenden Sie unbedingt tensidfreie Celluloseacetat-(SFCA-)Membranen, da andere Materialien das Virus binden und die Ausbeute erheblich verringern können.
6. Konzentrieren Sie das Virus mittels Ultrazentrifugation unter Verwendung einer Zentrifuge mit SW32-Rotor und drehen Sie sie 2,5 h bei 20.000 U/min (~72.000 x g) bei 4 °C.
7. Während das Virus unter Ultrazentrifugation konzentriert wird, behandeln Sie die CiA-mESCs in der 12-Loch-Platte mit frischem ES-Medium, das 5 µg/mL Polybrene enthält.
8. Wenn die Virus-Konzentration abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren das Virus-Pellet in 100 µL 1x PBS (vermeiden Sie überschüssige Bläschen).
9. Geben Sie das Virus und 1x PBS in ein 1,5-mL-Mikrofuge-Röhrchen. Vortexen/schütteln Sie das Röhrchen bei 300 x g (oder auf der niedrigsten Stufe), um das Virus vollständig zu suspendieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz (5–10 s) in einer Mini-Tischzentrifuge, um Bläschen zu entfernen.
10. Geben Sie 30 µL des Virus in jedes Loch einer 12-Loch-Platte. Schwenken Sie die Platte und zentrifugieren Sie sie anschließend bei 1.000 x g für 20 min.
    HINWEIS: Die Menge des hinzugefügten Virus kann je nach viraler Titer variiert werden, der umgekehrt proportional zur Größe des Transfektionskonstrukts ist.
    1. Alternativ können Sie das Virus mit flüssigem Stickstoff schnell einfrieren und bei -80 °C lagern. Das Einfrieren des Virus führt jedoch zu einer Absenkung des viralen Titers.
11. Stellen Sie die 12-Loch-Platte wieder in den 37 °C-Inkubator und wechseln Sie am folgenden Morgen (~16 h später) das Medium durch frisches ES-Medium.
12. Nach 48 h Infektion selektieren Sie die Zellen, die das virale Plasmid integriert haben, durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums (z. B. 1,5 µg/mL Puromycin, 10 µg/mL Blasticidin usw.). Wechseln Sie das Medium täglich und waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, falls die Mehrheit der Zellen schwebt/abgestorben ist. Belassen Sie das Selektionsmedium 72–96 h lang bei den Zellen in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (für Gewebekultur)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Einzelne Chargen auf Qualität geprüft
Viruszentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	344058
Membranfilter für Viren	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
0,25 % Trypsin	Gibco	25200-056	mit EDTA
0,05 % Trypsin	Gibco	25400-054	mit EDTA
Puromycin	InvivoGen	ant-pr
Ultrazentrifuge	Optima	XPN-80
SW-32 Zentrifugenrotor	Beckman Coulter	14U4354
SW-32 Ti Zentrifugenkörbe	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 Human embryonic kidney	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Die großzügige Spende von G. Crabtree
Lif-1C-alpha-produzierende Cos-Zellen	Die großzügige Spende von J. Wysocka