Dieses Video demonstriert die Erzeugung rekombinanter Vaccinia-Viren mittels plasmidvermittelter homologer Rekombination in infizierten epithelialen Zellen. Fluoreszierende und metabolische Marker ermöglichen die Selektion und Identifizierung von Viren, die markierte Proteine exprimieren.
Methodenartikel
Identifizierung von rekombinanten Vaccinia-Virus-infizierten Zellen mittels metabolischer und fluoreszierender Selektion
17 Aufrufe
⸱
30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Generierung rekombinanter Viren
- Wie in Abbildung 1 dargestellt, infizieren Sie eine Zellschicht aus BS-C-1-Zellen [Buffalo Subclone C-1 (eine aus CV-1-Zellen stammende epitheliale Zelllinie aus Affenniere)] mit Vaccinia-Virus in serumfreiem Medium bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) > 1.
- Eine Stunde nach der Infektion ersetzen Sie das Medium durch Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) und transfizieren die Zellen mit einem Gemisch aus Rekombinationsvektor-Plasmid und Transfektionsreagenz im Verhältnis 3:1 in serumfreiem Medium.
- Nach 24 Stunden schaben Sie die Zellen ab, sammeln sie in DMEM ohne fetalen Kälberserum (FBS) und führen drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die Zellen zu lysieren und Viruspartikel freizusetzen.
- Führen Sie einen Plaque-Assay mit flüssiger Überlagerung aus 10 % FBS in DMEM und GPT (Guaninphosphoribosyltransferase (aus E. coli)) Selektionsreagenzien, Mycophenolsäure (25 µg/ml) und Xanthin (250 µg/ml) wie folgt durch:
- Besiedeln Sie eine 6-Loch-Platte mit einer Zellschicht aus BS-C-1-Zellen.
- Infizieren Sie vollständig konfluente Zellschichten mit seriellen Verdünnungen der gefriergetauchten Zellen, die Viruspartikel enthalten, um eine ausreichende Trennung einzelner Plaques sicherzustellen.
- Überlagern Sie mit flüssigem DMEM mit 10 % FBS, das die GPT-Selektionsreagenzien – Mycophenolsäure und Xanthin – in Endkonzentrationen von jeweils 25 µg/ml und 250 µg/ml enthält.
- Nach einer 24-stündigen Inkubation entfernen Sie die flüssige Überlagerung und untersuchen Sie mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops Plaques, die eine diffuse rote Fluoreszenz aufweisen, die der Integration von mCherry aus dem TDS-(transient dominant selection) Vektor in das Virus entspricht. Abhängig vom Zielgen und dem gewählten fluoreszierenden Marker kann in denselben roten Plaques auch eine lokalisierte Fluoreszenz des markierten Gens beobachtet werden.
- Wählen Sie mehrere Plaques für jeden rekombinanten Virus durch lokales Abschaben mit einer Pipettenspitze und 100 µl DMEM mit 5 % FBS aus, um die Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen zu überführen. Führen Sie anschließend drei Gefrier-Tau-Zyklen der abgeschabten Zellen durch, um rekombinante Viren freizusetzen.
- Geben Sie das DMEM mit den gefriergetauchten Viren auf eine Zellschicht in einer 12-Loch-Platte, um rekombinante Viren mit GPT-Selektionsreagenzien im Wachstumsmedium zu amplifizieren. Schaben Sie erfolgreiche Amplifikationen 24 Stunden nach der Infektion ab.
- Führen Sie einen Plaque-Assay der erfolgreich amplifizierten, rot fluoreszierenden Plaques durch, diesmal mit einer Agarose-Überlagerung und GPT-Selektion, wie folgt:
- Besiedeln Sie eine 6-Loch-Platte mit einer Zellschicht aus BS-C-1-Zellen.
- Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie die Vertiefungen mit zunehmender Verdünnung der Viren in FBS-freiem DMEM.
- Eine Stunde nach der Infektion entfernen Sie das flüssige Medium und überlagern Sie jede Vertiefung mit 0,5 % Agarose in Minimal Essential Medium (MEM), das 2,5 % FBS, 292 µg/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin sowie die GPT-Selektionsreagenzien enthält.
- Wählen Sie zwei bis drei Tage nach der Infektion Plaques aus, die sowohl rote als auch die Farbe des gewählten fluoreszierenden Markers aufweisende Fluoreszenz zeigen, und amplifizieren Sie diese erneut, diesmal ohne GPT-Selektion.
- Führen Sie den nächsten Plaque-Assay mit einer Agarose-Überlagerung ohne Selektion durch.
- Wählen Sie Plaques aus, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz, die dem gewählten Marker entspricht, beibehalten haben.
- Setzen Sie die Plaque-Reinigung ohne Selektion fort, um einen reinen Vorrat an rekombinanten Viren zu erhalten, die die mCherry- und gpt-Seletionsgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz, die dem gewählten Marker entspricht, beibehalten. Überprüfen Sie die Reinheit der Vorräte mittels Plaque-Assay; alle Plaques sollten ein ähnliches Plaque-Phänotyp aufweisen.
Ergebnisse
Abbildung 1. Übersicht über das experimentelle Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vaccinia-Virus. Dargestellt sind Vorgänge auf genetischer und zellulärer Ebene sowie repräsentative Plaque-Bilder, die die Schritte nach der Erzeugung eines mit A3-GFP markierten fluoreszierenden Vaccinia-Virus veranschaulichen. (A) Mit Vaccinia-Virus infizierte Zellen werden mit dem TDS-Rekombinationsvektor transfiziert. (B) In dieser Abbildung ist lediglich das Ergebnis der linken Rekombination dargestellt; das Beispiel verwendet GFP als gewünschten fluoreszierenden Marker. Die Rekombination auf der rechten Seite würde analog dazu zur vollständigen Integration des gesamten TDS-Plasmids in das Genom führen, wobei der Marker im Zwischenschritt, d.h. Schritt C, an das gesamte Zielgen fusioniert wäre. Auf einer Zellmonolayer wird ein Plaque-Assay mit der Rekombinationsmischung durchgeführt und einer GPT-Selektion unterzogen. (C) Plaques, die sowohl rote als auch grüne Fluoreszenz zeigen, entsprechend der Expression von mCherry bzw. GFP, werden isoliert und amplifiziert. Nach Wegfall der Selektion geht die rote Fluoreszenz, die dem Verlust der Gene gpt und mCherry entspricht, verloren (D), und Plaques, die ausschließlich grüne Fluoreszenz aufweisen, werden ausgewählt und amplifiziert (E).
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mycophensäure | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | In 0,1 N NaOH lösen |
| Xanthin | Sigma-Aldrich | X0626-5G | In 0,1 N NaOH lösen |
| FuGENE-HD-Transfektionsreagenz | Promega | E2311 | |
| Fluoreszenzmikroskop mit Chroma-Filtern 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |
