Kombinierte adenovirale Transduktion und siRNA-vermittelter Knockdown in Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Fuchs, M. et al. Adenofektion: Eine Methode zur Untersuchung der Rolle molekularer Chaperone in der zellulären Morphodynamik mittels Depletions-Rettungs-Experimenten. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die adenovirusvermittelte Abgabe eines fluoreszierenden Transgens in Kombination mit siRNA-Calciumphosphat-Transfektion in Zervixkarzinomzellen. Der Adenovirus exprimiert ein fluoreszierendes Ersatzprotein, während die siRNA einen gezielten mRNA-Abbau über die Bindung an RISC auslöst. Diese sequenzielle Cotransfektion ermöglicht eine gleichzeitige Herunterregulation des endogenen Proteins und eine funktionelle Wiederherstellung durch das Transgen, wodurch die Visualisierung und Bestätigung des Proteinersatzes mittels Fluoreszenzbildgebung möglich wird.

Protokoll

1. Adenovirus-Transduktion und Knockdown des endogenen Proteins durch Transfektion mit small interfering RNA (siRNA) in HeLa-RFP-H2B-Zellen unter Verwendung von Calciumphosphat (CaPi)-Präzipitaten

HINWEIS: Ein Kontrolladenovirus, das ein nicht verwandtes Gen (z. B. LacZ) oder kein Gen trägt, wird verwendet, um in allen Adenofektionen eine minimale Multiplizität der Infektion (MOI) zu erreichen (10–20 plaque-bildende Einheiten (PFU)/Zelle), wobei die geringste Menge an rekombinantem Adenovirus verwendet wird, das das Gen der Interesse trägt.

HINWEIS: Dieses Verfahren hat sich als hilfreich erwiesen, um die Expression pro Zelle in einer großen Zellpopulation zu normalisieren.

1. Zählen Sie einen Tag nach der Zellplattierung die Anzahl der Zellen aus der zusätzlichen beplatteten Schale. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie einmal mit 1 mL 0,05 %iger Trypsin/Ethylenendiamintetraessigsäure (EDTA). Geben Sie erneut 1 mL 0,05 %igen Trypsin/EDTA zu und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂, bis sich alle Zellen gelöst haben. Dispergieren Sie die Zellen gründlich mit einer 1-mL-Pipette und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro mL mithilfe eines Hämozytometers.
2. Bestimmen Sie die Menge an Virus, die benötigt wird, um Zellen mit einem MOI von 2 PFU des Proteins von Interesse (POI) pro Zelle und 18 PFU pro Zelle eines leeren Vektors (z. B. LacZ) zu transduzieren, um insgesamt 20 PFU pro Zelle zu erreichen. Transduzieren Sie gleichzeitig jeweils 4 PFU der Baculoviren, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiertes Aktin und mit rot fluoreszierendem Protein (RFP) markiertes α-Tubulin kodieren. Transduzieren Sie die Zellen nach dem folgenden Adenofektionsprotokoll.
3. Bereiten Sie in einem sterilen Gehäuse pro Bedingung ein 1,5-mL-Kunststoffröhrchen vor und geben Sie 400 μL warmes alpha-Minimum-Essential-Medium (αMEM) hinzu.
4. Tauen Sie eine Aliquotprobe der Viren langsam auf Eis auf und verdünnen Sie gegebenenfalls den Virusstamm, um ein Volumen von mehr als 1 μL pipettieren zu können, um Pipettierfehler zu minimieren.
5. Geben Sie die berechnete Virusmenge pro Bedingung zu jedem 1,5-mL-Kunststoffröhrchen mit 400 μL αMEM hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Stellen Sie den Virusstamm unverzüglich wieder bei -80 °C auf, um seine Aktivität zu erhalten.
6. Aspirieren Sie das Medium von den Zellen und pipettieren Sie die Virusmischung vorsichtig tropfenweise auf. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ und schütteln Sie die Platten vorsichtig alle 15 Minuten während 1 Stunde unter dem sterilen Gehäuse, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig mit dem Virus bedeckt sind. Die Verwendung einer geringen Menge Medium erleichtert den Kontakt zwischen Virus und Zellen.
7. Nach der Inkubation pipettieren Sie vorsichtig 1,6 mL αMEM zu jeder Platte, um ein Gesamtvolumen von 2 mL zu erreichen, beginnen Sie die Zellsynchronisierung durch Zugabe von 2 mM Thymidin und inkubieren Sie die Zellen weitere 2 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂.
8. Bereiten Sie inzwischen die siRNA-Transfektionsmischung nach der CaPi-Transfektionsmethode vor (siehe Abbildung 1). Falls keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die siRNA-Menge durch sterilem Wasser, um eine leere Transfektion durchzuführen.
9. Berechnen Sie 200 μL Mischung pro Bedingung, was 400 μL pro Duplikat ergibt. Das folgende Beispiel gilt für eine endgültige siRNA-Konzentration von 50 nM und muss für jedes Protein von Interesse angepasst werden. Pipettieren Sie in ein 1,5-mL-Kunststoffröhrchen 50 μL 1 M CaCl₂ und 11 μL 20 μM siRNA in 139 μL sterilem H₂O und mischen Sie durch Vortexen. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt geben Sie vorsichtig 200 μL 2× HEPES-puffertes Salz (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01–7,05) tropfenweise hinzu.
   HINWEIS: Je kleiner die Tropfen, desto kleiner die Präzipitate, was zu einer besseren Transfektionseffizienz führt. Mischen Sie vorsichtig dreimal durch Luftinjektion mit einer 200-μL-Pipette.
10. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Geben Sie langsam 200 μL der Transfektionsmischung zu jeder Platte und schütteln Sie kreuzweise. Überführen Sie die Platten für 16 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂.
11. Am nächsten Tag spülen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL warmem HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) und geben Sie 2 mL αMEM hinzu. Bearbeiten Sie nicht mehr als vier Zellplatten gleichzeitig, da Temperaturschwankungen die Dauer des Zellzyklus beeinflussen.
12. Überprüfen Sie die Infektionseffizienz unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von 20–40fach (Luftobjektiv) und nehmen Sie je drei repräsentative Bilder pro Bedingung in beiden Fluoreszenz- und Transmissionskanälen zur Dokumentation auf. Sieben Stunden später fügen Sie 2 mM Thymidin hinzu und inkubieren weitere 16 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂.
13. Am folgenden Tag, 48 Stunden nach siRNA-Transfektion und Virusinfektion, spülen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL warmem phosphatgepuffertem Salzlösung (PBS) und inkubieren Sie sie 7 Stunden in 2 mL αMEM ohne Phenolrot für Live-Cell-Bildgebung oder mit Phenolrot für die Proteinextraktion.
14. Sammlen Sie die Zellen je Bedingung 48 Stunden nach der Transfektion zur Herstellung von Proteinauszügen und zur Western-Blot-Analyse, um die Effizienz der Genunterdrückung und die Expression des endogenen Proteins zu bestimmen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Antikörper gegen das Protein von Interesse sowie geeignete Antikörper als Ladekontrollen. Die Effizienz der Genunterdrückung sollte bestimmt werden, indem abnehmende Mengen an Lysaten von Kontrollzellen (transfiziert mit Kontroll-siRNA) geladen werden, um eine Titrationskurve zu erhalten (z. B. 1, ½, ¼, ⅛).

Ergebnisse

Abbildung 1. Planung eines typischen Adenofektionsprotokolls. Die aufeinanderfolgenden Schritte eines typischen Experiments werden dargestellt, und zwar für das Protokoll unter Verwendung von CaPi-Fällungen (unterstrichen in Grau) oder das Protokoll unter Verwendung eines kationischen Lipid-Transfektionsreagenz (hervorgehoben in Gelb), einschließlich Zellansaat, Transduktion von Adeno- und Baculoviren, Transfektion von siRNA-Duplexen und Zellsynchronisierung mittels eines doppelten Thymidin-Blocks. Die Zeitpläne in Stunden für beide Protokolle sind rechts in der Abbildung dargestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
EDTA	Sigma	E5134
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glasbodenschalen, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Entgegenkommenderweise zur Verfügung gestellt von Dr. Sabine Elowe, Québec, Kanada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamin	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Minimal essenzielles Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal essenzielles Medium (MEM) Alpha ohne Desoxyribonukleoside/Ribonukleoside	Thermo Fisher	12000-022
Minimal essenzielles Medium (MEM) Alpha ohne Phenolrot	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Adenovirus, kundenspezifische Konstruktion	Welgen	Custom design
Calciumchlorid	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
siRNA-Duplexe	Dharmacon	Custom design
Thymidin	Sigma	T9250
Trypsin 2,5 %	Thermo Fisher	15090-046