Markierung von oberflächenzugänglichen Cysteinresten in biotechnologisch hergestellten virusähnlichen Partikeln

Zusammenfassung

Quelle: Natilla, A., und Hammond, R. W. Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cysteinresten auf Virus-ähnlichen Partikeln des Maisstreifenvirus, hergestellt in Nicotiana benthamiana-Pflanzen, und Vernetzung von Peptiden an VLPs. J. Vis. Exp. (2013)

Dieses Video zeigt die ortsspezifische fluoreszierende Markierung von in Nicotiana benthamiana hergestellten mutierten Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) mittels eines thiolreaktiven Farbstoffs, gefolgt von der Reinigung und Gelelektrophorese zur Bestätigung der Oberflächenmodifizierung.

Protokoll

1. Virusinokulation und VLP-Reinigung aus Nicotiana benthamiana-Pflanzen

1. Erzeugen Sie kappte T7-RNA-Transkripte aus auf Kartoffelvirus X (PVX) basierenden Vektor-Plasmiden, die die Wildtyp-(wt)- und cysteinmutierte Hüllprotein-(CP)-Gene des Mais rayado fino Virus (MRFV) tragen, unter Verwendung des T7-mMessage mMachine Kits von Ambion.
2. Inokulieren Sie für jede T7-Transkript-Reaktion zwei vollständig entfaltete Blätter von N. benthamiana mit jeweils 10 μL Reaktionsansatz und inkubieren Sie die Pflanzen 10 Tage lang im Gewächshaus bei 60 % Luftfeuchtigkeit, 16 Stunden Licht (25.000–30.000 Lux) bei 25 °C und 8 Stunden Dunkelheit bei 20 °C.
3. Ernten Sie 10 Tage nach Inokulation (dpi) die virusinfizierten N. benthamiana-Blätter, wiegen Sie das Pflanzengewebe (50 Gramm) ab und stellen Sie es auf Eis.
4. Homogenisieren Sie das Pflanzenmaterial in einem Mixer unter Zugabe von 100 mL einer gekühlten Lösung aus 0,5 M Na-Citratpuffer, pH 5,5 (verwenden Sie 2 mL Puffer pro Gramm Pflanzengewebe).
5. Filtrieren Sie das Homogenat durch drei Schichten Mullbinde und klären Sie es durch Zentrifugation bei 27.000 × g für 30 Minuten. Überführen Sie das Überstandsvolumen in einen gekühlten Messzylinder, messen Sie das Volumen und übertragen Sie es anschließend in einen gekühlten sterilen Becher. Entsorgen Sie das Pellet.
6. Verarbeiten Sie den Überstand, indem Sie 10 % Polyethylenglykol 8.000 (PEG 8.000) hinzufügen, 15 Minuten bei 4 °C rühren und anschließend weitere 45 Minuten bei 4 °C inkubieren, um die Matrix aus virusähnlichen Partikeln (VLPs) und PEG auszufällen.
7. Zentrifugieren Sie die Probe bei 27.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
8. Verarbeiten Sie das Pellet, indem Sie 8 mL eines 0,05 M Na-Citratpuffers, pH 5,5, mit 2 % Triton X-100 hinzufügen. Schwenken Sie die Zentrifugenröhrchen gut, um das Pellet zu lösen. Überführen Sie das Pellet und den Puffer in einen gekühlten sterilen Becher. Spülen Sie die Röhrchen sofort mit 2 mL desselben Puffers nach und geben Sie dies zum Becher hinzu. Rühren Sie die Suspension bei 4 °C, bis die Pellets vollständig gelöst sind (in der Regel 1 Stunde).
9. Klären Sie durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 27.000 × g, verwerfen Sie das Pellet und verarbeiten Sie den Überstand durch Zentrifugation bei 140.000 × g für 2 Stunden bei 4 °C.
10. Lösen Sie das Pellet in 1 mL 0,05 M Na-Citratpuffer, pH 5,5, auf und geben Sie die Suspension auf eine 10–40 %ige Saccharosegradienten, die in 0,05 M Na-Citratpuffer, pH 5,5, hergestellt wurde.
11. Zentrifugieren Sie den Gradienten 3 Stunden lang bei 140.000 × g bei 4 °C.
12. Leuchten Sie mit einem Lichtstrahl auf das obere Ende des Zentrifugenröhrchens und sammeln Sie das streuende obere Band 4 cm vom Röhrchenrand entfernt, verdünnen Sie es mit 0,05 M Na-Citratpuffer, pH 5,5, und zentrifugieren Sie 3 Stunden lang bei 140.000 × g bei 4 °C.
13. Lösen Sie das Pellet in 0,5 mL sterilem Wasser auf und lagern Sie es bei 4 °C bis zu sechs Monate lang.
14. Bestimmen Sie die VLPs-Konzentration durch Durchführung eines Bradford-Protein-Assays. Die Ausbeute an VLPs liegt zwischen 1 und 3 μg pro Gramm Pflanzengewebe.

2. Fluorescein-5-maleimid-Markierungsreaktionen von VLPs

1. Stellen Sie eine 1 mM Lösung von Fluorescein-5-maleimid (427,37 g/mol) in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0; 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) her. Mischen Sie mit einem Vortex und überprüfen Sie die vollständige Auflösung. Schützen Sie das Röhrchen vor Licht mithilfe von Aluminiumfolie.
2. Geben Sie Fluorescein-5-maleimid zu den in Schritt 1 hergestellten VLPs hinzu und mischen Sie. Verwenden Sie ein 25-faches molares Überschuss an Fluorescein-5-maleimid bezogen auf die molare Menge an Sulfhydrylgruppen. Im Allgemeinen erzielt man akzeptable Ergebnisse, wenn man 30 μL VLPs mit einer Konzentration von 1 μg/μL und 60 μL der Fluorescein-5-maleimid-Lösung verwendet.
3. Inkubieren Sie die Reaktion 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
4. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) auf eine Endkonzentration von 50 mM.
5. Entfernen Sie nicht umgesetztes Fluorescein mithilfe einer Desalting-Spin-Säule (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) und Zentrifugation für 2 min bei 1.500 × g bei Raumtemperatur.
6. Fügen Sie für die Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse jeweils 10 μL 2 × SDS-PAGE-Lämmli-Probelösung zu 10 μL jeder Reaktion hinzu. Lagern Sie das markierte Protein lichtgeschützt bei 4 °C bis zu einem Monat oder in Einmalportionen bei -20 °C bis zu 3 Monate.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dünne Wand, ultraklare Röhrchen	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Life Tecnologies	AM1344M
Fluorescein-5-Maleimid	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 ist nicht verfügbar, durch F150 ersetzen
Laemmli-Puffer	Bio-Rad	1610737
Tris-Glycin-SDS-(Natriumdodecylsulfat-)Laufpuffer	Invitrogen	LC2675
Tris-Glycin-Transferpuffer	Invitrogen	LC3675
Sandwich aus Nitrocellulose-Membran und Filterpapier	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimid-Polyethylenglykol (PEG) 2-Biotin, No-Weigh-Format	Thermo Scientific	21901