Produktion von virusähnlichen Partikeln in modifizierten E. coli

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Z., et al. Herstellung von konjugationsinduzierten fluoreszierenden PEGylierten Virus-ähnlichen Partikeln mittels Dibrommaleimid-Disulfid-Chemie. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video wird die Methode zur kontrollierten Expression des Kapsidproteins des Bakteriophagen Qβ in modifizierten E. coli demonstriert. Die resultierenden Proteine lagern sich selbst zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die für die nachgeschaltete Biokonjugation gewonnen werden.

Protokoll

Expression von Qβ

1. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit einer 1:1-Bleichmittel/Ethanol-Lösung.
2. Stellen Sie in einer sterilen Umgebung zwei Starterkulturen mit je 3 mL her, indem Sie einzelne Kolonien von E. coli BL21(DE3) in jeweils 3 mL Super Optimal Broth (SOB)-Medium geben.
3. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht auf einem Schüttler bei 250 rpm in einem Raum mit 37 °C und 0 % relativer Luftfeuchtigkeit (rH).
4. Inokulieren Sie die Starterkultur in SOB-Medium:
   1. Nehmen Sie beide 3-mL-Starterkulturen vom Schüttler und gießen Sie in einer sterilen Umgebung jeweils eine Kultur in einen der beiden 2-L-Schüttkolben mit Baffeln, die jeweils 1 L frisches SOB-Medium enthalten.
   2. Stellen Sie das inokulierte Medium auf einen Schüttler bei 250 rpm in einem Raum mit 37 °C und 0 % rH.
5. Züchten Sie die Bakterien auf einem Schüttler bei 250 rpm in einem Raum mit 37 °C und 0 % rH, bis der OD₆₀₀ den Wert von 0,9–1,0 erreicht hat.
6. Geben Sie 1 mL 1 M Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) mit einer P1000-Pipette zu, um die Proteinsynthese zu induzieren.
7. Lassen Sie das Medium über Nacht auf dem Schüttler bei 250 rpm in einem Raum mit 37 °C und 0 % rH.
8. Entfernen Sie das Medium am folgenden Morgen vom Schüttler und zentrifugieren Sie es in 1000-mL-Flaschen bei 20.621 × g für 1 h bei 4 °C, um die Zellen zu gewinnen.
9. Entfernen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.
   1. Gießen Sie den Überstand in einen Kolben mit etwa 5 mL Bleichmittel, um die Bakterien abzutöten. Dies ist Abfall.
   2. Verwenden Sie einen Spatel, um das Zellpellet vom Boden der Zentrifugenflasche abzukratzen, und geben Sie das Pellet in ein 50-mL-Zentrifugenröhrchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB-Brühe (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, Pulver	Research Products International	T60060-1000.0
Hefeextrakt, Pulver	Research Products International	Y20020-1000.0
Wasserfreies Magnesiumsulfat	P212121	CI-06808-1KG
Natriumchlorid (kristallin/zertifiziert nach ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Wasseraufreinigungsanlage	Fisher Scientific	4474524
Monobasisches Kaliumphosphat	Fisher Scientific	BP362-1
Wasserfreies dibasisches Kaliumphosphat	Fisher Scientific	P288-500
Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Nalgene-Zentrifugenflaschen mit Verschlüssen, aus Polypropylen-Copolymer	Thermo Scientific	3141-0250
VWR Os-500 Orbitalschüttler	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
Falcon 50 mL kegelförmige Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-432-22