Sichere Präparation von Virusproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Blancett, C. D., et al. Nutzung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt die sichere Probenvorbereitung von Virusproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Die Viruspartikel werden mit Glutaraldehyd fixiert, mit einem elektronendichten Farbstoff gefärbt und einer Dampffixierung mit Osmiumtetroxid unterzogen, um die Strukturen zu stabilisieren und eine vollständige Inaktivierung zu gewährleisten. Dadurch wird sicheres Arbeiten mit Virusproben ermöglicht und der Kontrast für hochwertige TEM-Aufnahmen verbessert.

Protokoll

1. Die Kapselmethode für die negative Färbung unter Biocontainment-Bedingungen unter Verwendung von wässrigem Glutaraldehyd und 1 % Osmiumtetroxid-Dampfinaktivierung

1. Innerhalb des Biocontainment-Biosicherheitswerkbanks (BSC) 40 µL Virus-Suspension in die an eine Pipette angebrachte Kapsel aufsaugen.
   HINWEIS: Die Pipette bleibt bis zum Abschluss des Prozesses an der Kapsel befestigt.
2. Legen Sie die Pipette 10 min lang seitlich ab, wobei die Gitter horizontal ausgerichtet sein sollen. Dies dient der gleichmäßigen Verteilung der Viruspartikel auf den beschichteten Gittern.
3. Inaktivieren Sie das Virus innerhalb der Kapsel im Biocontainment-BSC.
   1. Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um die Viruslösung in einen Abfallbehälter abzugeben.
   2. Saugen Sie 40 µL 2 % Glutaraldehyd-Fixiermittel in die Kapseln auf. Vorsicht: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert angemessenen Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, bei längerer Offenlegung des Reagenz muss jedoch in einem abgesaugten BSC oder in einer chemischen Abzugshaube gearbeitet werden.
   3. Legen Sie die Pipette 20 min lang seitlich ab. Dies dient der sicheren Fixierung der Proben.
   4. Drücken Sie das Fixiermittel aus und saugen Sie 40 µL DI-Wasser (deionisiertes Wasser) in die Kapseln, um das Fixiermittel abzuwaschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt dreimal.
4. Saugen Sie 40 µL entweder 1 % Uranylacetat (UA) oder 1 % Kaliumphosphorwolframsäure (PTA) in die Kapseln und lassen Sie die Lösung 30 s einwirken.
   HINWEIS: Die Färbedauer kann je nach Virusprobe zwischen 10 s und 1 min variieren.
   ACHTUNG: UA ist ein Alphastrahler und ein kumulatives Toxin. Handhaben Sie es mit angemessenem Schutz.
5. Entfernen Sie die Kapsel von der Pipette und trocknen Sie die Gitter ab, indem Sie ein Stück Filterpapier an den Rand der Gitter halten, während sich die Gitter weiterhin in der Kapsel befinden.
6. Verfahren zur Inaktivierung mittels Osmiumtetroxid-Dampf.
   1. Stellen Sie die Kapsel mit geöffnetem Deckel in ein 50-mL-Zentrifugenröhrchen, das Filterpapier enthält, das in einer 1 %igen Osmiumtetroxidlösung getränkt ist. Vorsicht: Osmiumtetroxid ist äußerst toxisch und hat einen niedrigen Dampfdruck. Es muss in einem abgesaugten BSC oder in einer chemischen Abzugshaube verwendet werden. Handhaben Sie es mit angemessenem Schutz. Stellen Sie Warnhinweise im Arbeitsbereich auf.
   2. Verschließen Sie das 50-mL-Zentrifugenröhrchen für 1 h, um eine vollständige Durchdringung durch den Osmiumtetroxid-Dampf zu ermöglichen. Danach desinfizieren und überführen Sie das Röhrchen aus dem Biocontainment in die BSL-2-EM-Einrichtung (Elektronenmikroskopie).
7. Entfernen Sie die EM-Gitter aus der Kapsel.
   1. Entfernen Sie im BSL-2-EM-Labor die Kapsel aus dem Zentrifugenröhrchen und setzen Sie sie auf eine Pipette auf.
   2. Saugen Sie 40 µL DI-Wasser in die Kapsel und geben Sie das Wasser dreimal in einen Abfallbehälter ab.
   3. Entfernen Sie die Kapsel von der Pipette und trocknen Sie die Gitter mit Filterpapier ab, indem Sie den Rand der Gitter berühren.
   4. Lagern Sie die Gitter nach dem Lufttrocknen für die anschließende TEM-Bildgebung (Transmissionselektronenmikroskopie).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Formvar-/Kohlenstoff-beschichtete TEM-Gitter	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g-Kapseln	EMS	85010-01	Box
mPrep/f-Kupplungen	EMS	85010-11	Standard 16/Pk
Glutaraldehyd	EMS	16320	50%ige Lösung, EM-Reinheit
Osmiumtetroxid	EMS	19190	4%ige wässrige Lösung
Uranylacetat	EMS	22400	Pulver
Kaliumphosphorwolframsäure	EMS	19500	Pulver
Filterpapier	Whatman	1450-090	Größe 50
Transmissionselektronenmikroskop	JEOL	JEM-1011	TEM