Visualisierung von Hepatitis-E-Virus-Nanopartikeln mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Chen, C. C., et al. Oberflächenfunktionalisierung von Hepatitis-E-Virus-Nanopartikeln mittels chemischer Konjugationsmethoden. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Herstellung und negative Färbung von hepatitis-E-virusähnlichen Nanopartikeln zur Visualisierung mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Die Methode verdeutlicht die strukturelle Integrität von selbstassemblierenden, nur aus Kapsid bestehenden Partikeln und bestätigt deren Gleichförmigkeit und Reinheit durch hochauflösende Abbildung.

Protokoll

1. Beobachtung der Hepatitis-E-Virus-Nanopartikel (HEVNPs) mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
   1. Bereiten Sie die HEVNP-Proben vor oder verdünnen Sie sie auf 0,5 - 2 mg/mL mit 10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) pH 6,2 für die TEM-Bildgebung.
   2. Ionisieren Sie die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter mit einer 40 mA-Glühentladung für 30 s, um eine hydrophile Kohlenstoffoberfläche zu erzeugen. Die Glühentladungsausrüstung ist in der Materialtabelle beschrieben.
      HINWEIS: Die hydrophile Kohlenstoffoberfläche der Gitter hält nur 30 Minuten nach der Glühentladungsbehandlung an.
   3. Halten Sie das Gitter mit einer Pinzette und geben Sie 2 µL HEVNP-Probe auf das Gitter, warten Sie 15 - 30 s und tupfen Sie mit Filterpapier ab.
   4. Spülen Sie das Gitter sofort mit ddH₂0 und tupfen Sie es mit Filterpapier ab.
   5. Geben Sie sofort 2 µL 2 % Uranylacetat auf das Gitter, warten Sie 15 s und tupfen Sie mit Filterpapier ab. Trocknen Sie die Proben-Gitter, indem Sie sie über Nacht in einen elektronischen entfeuchtenden Trockenschrank stellen.
   6. Überführen Sie das Gitter in ein TEM und nehmen Sie Bilder mit 10-80k-facher Vergrößerung auf. HEVNPs erscheinen im TEM als leere ikosaedrische Proteine mit einem Durchmesser von etwa 27 nm, bedingt durch das Fehlen viraler RNA.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MES-Hydrat	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
EMS-Glühentlader	Electron Microscopy Science		Glühentlader