Das Video zeigt die Detektion von Zika-viralen dsRNA-Zwischenprodukten in infizierten epithelialen Zellen mittels Immunzytochemie. Infizierte Zellen werden fixiert und anschließend mit einer Blockierungslösung blockiert. Die primären und sekundären Antikörper werden hinzugefügt. Die Kerne werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Die markierte virale dsRNA wird dann unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.
Methodenartikel
Nachweis von dsRNA-Replikationsintermediaten des Zika-Virus mittels Immunzytochemie
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30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Replikations-Assay des Zika-Virusgenoms
- Säen Sie naive Vero-Zellen mit 1 x 105 Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumen unter Verwendung einer 12-Loch-Platte aus. Bereiten Sie am folgenden Tag virale Inokula (Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 und 0,1; 400 µl/Vertiefung) mit niedriger und hoher Titer unter Verwendung von serumfreiem Medium in dreifacher Ausführung vor. Verwenden Sie für die Scheininfektion ausschließlich serumfreies Medium (400 µl/Vertiefung).
- Inkubieren Sie die beimpfte Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 für 4–6 Stunden. Verteilen Sie das Inokulum, indem Sie die Platte alle 60 Minuten vorsichtig seitlich kippen.
- Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Inokulum durch serumhaltiges Medium (2 ml pro Vertiefung).
- Zu den Zeitpunkten 48 und 96 Stunden sammeln Sie die Proben für die immunzytochemische Untersuchung (ICC).
- Führen Sie die ICC mit methanol-fixierten Zellen durch.
- Waschen Sie die fixierten Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und blockieren Sie sie mit ICC-Blockierpuffer (3 % Zieuserserum, 3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 % Triton-X-100 in PBS).
- Verwenden Sie die monoklonale Maus-Anti-dsRNA-Antikörper J2 (1 µg/ml) im Verdünnungsverhältnis 1:100 im Blockierpuffer und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS und geben Sie einen sekundären Antikörper, Ziege-anti-Maus-IgG-594 (1 µg/ml), im Verdünnungsverhältnis 1:1.000 im Blockierpuffer hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, färben Sie die Kerne mit Hoechst-Farbstoff und betrachten Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100facher Vergrößerung (Abbildung 1).
Ergebnisse
Abbildung 1: Assays zur Beurteilung der Zika-Virus-(ZIKV-)Replikation. (A) Der Graph zeigt den genomischen Gehalt des Zika-Virus, gemessen mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Sowohl pan-genotypische (ZIKV GEN) als auch PRVABC59-Stamm-spezifische (ZIKV UNI) Primer zeigten gleiche Empfindlichkeit und Spezifität. Wie erwartet amplifizierten Hepatitis-C-Virus-(HCV-)Primer kein Produkt. (B) Der Graph zeigt die Wachstumsdynamik des Zika-Virus zu den angegebenen Zeitpunkten in Zellen mit niedriger und hoher Titerinfektion im Vergleich zur nicht infizierten Mock-Kontrolle. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen. (C) Immunzytochemischer Assay zur Untersuchung der Virusreplikation. Mit dem Zika-Virus infizierte Zellen wurden spezifisch mit dsRNA-Antikörpern angefärbt. Bei 48 hpi finden sich infizierte Zellen in wenigen Clustern, während bei 96 hpi die Mehrheit der Zellen infiziert ist. Zur Visualisierung der Zellkerne wurde Hoechst-Färbung verwendet (Maßstabsbalken = 50 µm). BF: Hellfeldaufnahme.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Maus-monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Alexa-Fluor-594 | Life Technologies | A11020 | |
| Vero-Zelllinie | ATCC | CCL-81 | |
| Zika-Virusstamm PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
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