Konzentrierung und Aufreinigung von viralen Partikeln

Zusammenfassung

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Konstruktion, Verpackung und Abgabe von hochtitrigen CRISPR-Retro- und Lentiviren mittels stereotaktischer Injektion. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt den schrittweisen Prozess zur Konzentrierung und Reinigung von Lentiviren aus einer gemischten Suspension, die Wirtszelltrümmer enthält. Das Verfahren nutzt Zentrifugation, Filtration und PEG-Salz-Fällung, um virale Partikel zu isolieren und lösliche Verunreinigungen zu entfernen. Das Endprodukt wird in einem Puffer resuspendiert und bei ultratiefen Temperaturen gelagert, um die virale Infektiosität und strukturelle Integrität zu bewahren.

Protokoll

1. Konzentration und Reinigung des Virus

1. Stellen Sie eine 5x-Lösung von Polyethylenglykol 6000 her, indem Sie 40 % Polyethylenglykol 6000 und 1,5 M NaCl zu ddH₂O hinzufügen. Autoklavieren Sie die Lösung im Flüssigkeitszyklus 45 min bei 121 °C. Rühren Sie die Lösung langsam während des Abkühlens.
   HINWEIS: Die Lösung ist zunächst trüb und wird beim Abkühlen klar.
2. Zentrifugieren Sie den 50-ml-Konischkolben, der beide Sammlungen des viralen Überstandes enthält, 10 min bei 2.000 x g, um unlösliches Material zu pelletieren. Reinigen Sie das virale Medium durch Filtration über einen 0,45-µm-Spritzenfilter mit geringer Proteinbindung (PES oder PVDF).
3. Geben Sie die 5x-Lösung von Polyethylenglykol 6000 zum Medium hinzu (die Endkonzentration sollte 8 % Polyethylenglykol 6000 und 0,3 M NaCl betragen). Mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens (nicht wirbeln). Inkubieren Sie die das Virus enthaltende Polyethylenglykol-Lösung 12 oder mehr Stunden bei 4 °C, gelegentlich erneut umgemischt.
4. (Tag 9) Zentrifugieren Sie die das Virus enthaltende Polyethylenglykol-Lösung 45 min bei 2.500 x g. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie erneut 2 min. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand erneut.
5. Lösen Sie das Pellet auf, indem Sie 320 µl sterile, phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzufügen (die 320 µl entsprechen 1/100 des ursprünglichen Volumens des gesammelten virushaltigen Mediums) und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C. Optional können Sie das Pellet 30 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler resuspendieren.
6. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Pellets portionieren Sie das Virus (5–10 µl pro 0,5-ml-Röhrchen) und frieren die Aliquots bei -80 °C ein (mehrmaliges Einfrieren und Auftauen oder Lagerung bei 4 °C reduziert die Titer stark).
7. Bestimmen Sie die Virus-Titer mit Standardprotokollen, z. B. durch Durchführung einer Verdünnungsreihe auf einer 6-Loch-Platte mit HEK293T-Zellen und manuelle Zählung der fluoreszierenden Kolonien 48 Stunden später.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Liste der Transfektionsreagenzien
5-ml-Polystyrolröhrchen	Fisher Scientific	352054
Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A