Evaluierung eines flüssigen Overlay-Systems für virale Plaque-Assays

Zusammenfassung

Quelle: Baer, A. und Kehn-Hall, K. Bestimmung der Virus-Konzentration mittels Plaque-Assays: Verwendung traditioneller und neuartiger Überzugsysteme. J. Vis. Exp. (2014).

In diesem Video wird die Verwendung einer flüssigen, mikrokristallinen Cellulose-basierten Abdeckung in einem Plaque-basierten Assay demonstriert, indem ihre Wirksamkeit bei der viralen Plaque-Bildung mit der einer traditionellen halbfesten Agarose-Abdeckung verglichen wird.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen und Reagenzien

1. Am Tag vor dem Assay die geeigneten Wirtszellen für das betreffende Virus ansäen (Tabelle 1 und Tabelle 2) bei 90–100 % Konfluenz.
2. Bereiten Sie eine Fixierlösung mit 10 % Formaldehyd in H₂Beispielweise 5,56 ml einer 36%igen Formaldehydstammlösung mit 14,44 ml destilliertem H₂O (dH₂O)₂O)
   HINWEIS: Beachten Sie beim Umgang mit Formaldehyd geeignete Sicherheitsmaßnahmen und sorgen Sie für ausreichende Belüftung.
3. Kristallviolett-Färbung herstellen: 1 % Kristallviolett (CV) in 20 % Ethanol und dH₂O₂O.
4. Bereiten Sie 2x Plaque-Medien vor (zelltypabhängig in 2x-Konzentration; siehe Tabelle 2). Filtrieren Sie mit einem 0.2 µm filtrieren, falls Reagenzien nicht steril sind
5. Herstellung immobilisierender Überlagerungen (Tabelle 3)
   1. Für flüssige Überlagerungen stellen Sie eine sterile 2,4%ige Lösung von Avicel in dH₂O her.₂O. Um Klumpenbildung zu vermeiden, das Pulver zu einem Kolben mit Wasser hinzufügen, das mit einem Rührstab schnell gerührt wird, Avicel langsam eintragen und bei Raumtemperatur (RT) rasch umrühren. Wenn die Lösung zu viskos wird, um sie mit einem Rührstab homogenisieren zu können, auf einen Kolbenschüttler umstellen für >30 min mit starker Agitation, um eine gleichmäßige Homogenisierung sicherzustellen.
      HINWEIS: Stammlösungen können in niedrigeren Konzentrationen hergestellt werden, jedoch besteht die Gefahr der Phasentrennung, sodass eine erneute Vermischung zur Sicherstellung der Homogenisierung erforderlich ist. Arbeitsschlurrie aus Avicel können in Konzentrationen von 0,6–3 % verwendet werden.
   2. Nach der Homogenisierung die Lösung autoklavieren und verschlossen bei Raumtemperatur lagern.
   3. Für Agarose- und Carboxymethylcellulose- (CMC-) Überlagerungen bereiten Sie eine Stammlösung in dH₂O vor.₂O von 2 % CMC oder 0,6 % Agarose. Mit einem Rührstab mischen und im Autoklaven oder in der Mikrowelle auflösen.

2. Verdünnungen und Infektionen

1. Am Tag nach der Aussaat die Konfluenz und Vitalität der Zellen visuell überprüfen, bevor mit dem Assay begonnen wird. Sicherstellen, dass die standardmäßige zelluläre Morphologie vorliegt und eine etwa 90 % konfluente Zellschicht vorhanden ist.
2. Durchführen einer zehnfachen seriellen Verdünnung der infektiösen Proben. Als Verdünnungsmittel das für die virale Vermehrung verwendete Zellkulturmedium verwenden (Tabelle 2). Die Anzahl der erforderlichen Verdünnungen je nach erwarteter Virus-Titer anpassen und stets eine nicht infizierte Kontrollprobe mitführen, um die Zellvitalität unabhängig zu überprüfen und die Identifizierung der Plaques zu erleichtern.
3. Die Zellen mit den seriellen Verdünnungen für 45 Minuten bis 1 Stunde infizieren (Tabelle 1). Eine ausreichende Menge Inokulum verwenden, um die Zellen zu bedecken, dabei jedoch das Volumen so gering wie möglich halten, um den viralen Kontakt mit der Zellschicht zu maximieren (Tabelle 4). Die Platten alle 20 Minuten vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen und ein Austrocknen der Zellschicht zu verhindern.
4. Nach der Infektion eine geeignete Menge immobilisierendes Medium direkt auf das Inokulum in der Mulde auftragen (Tabelle 2), wobei ein 1:1-Gemisch aus 2x Plaque-Medium und dem gewählten immobilisierenden Überzug (CMC, Agarose oder Avicel) verwendet wird. Vorsichtig schwenken, um zu mischen.
   1. Bei flüssigen Überzügen 1:1 mit erwärmtem 2x Plaque-Medium und 1,2–2,4 %iger RT-Avicel-Grundlösung mischen, um eine Arbeitslösung mit 0,6–1,2 % Avicel-Überzugmedium zu erhalten.
   2. Bei einem Agarose-Überzug ein 1:1-Gemisch aus erwärmtem 2x Plaque-Medium und einer vorgewärmten 0,6 %igen Agarose-Grundlösung herstellen und 30 Minuten lang in einem 56 °C warmen Wasserbad temperieren, um die Temperatur auszugleichen; die endgültige Konzentration an Agarose/Überzug beträgt dann 0,3 %.
   3. Bei CMC eine 2 %ige Grundlösung herstellen und wie für den Agarose-Überzug beschrieben weiterverarbeiten.
   4. Beim Auftragen des Überzugs auf die Zellschicht stets heiße Agarose- oder CMC-Lösungen im 56 °C warmen Wasserbad temperieren, um Schäden an der Zellschicht zu vermeiden. Sicherstellen, dass die Lösung warm, aber nicht heiß anfühlt, um Zelltod und verminderte Virus-Titer zu verhindern. Die meisten Agarose-Überzüge beginnen unterhalb von 42 °C zu erstarren; daher schnell arbeiten und/oder kleine Chargen anfertigen, um ein Erstarren während der Handhabung zu vermeiden.
5. Nach Zugabe des Überzugs die Platten inkubieren, bis deutlich abgegrenzte und eindeutig zählbare Plaques entstehen. Die Plaque-Bildung kann je nach analysiertem Virus 2–14 Tage dauern (Tabelle 1).
   HINWEIS: Sobald Platten mit flüssigem Überzug in den Inkubator gestellt wurden, dürfen sie nicht mehr bewegt werden. Bewegungen während der Inkubation führen zu verschmierten Plaques. Agarose- und CMC-Überzüge sind halbfest und können während der Inkubation periodisch unter dem Lichtmikroskop überprüft oder vorsichtig bewegt werden, um die Plaque-Entwicklung zu überwachen.

3. Fixierung und Färbung von Zellen

1. Um die Zellen zu fixieren, gießen Sie die Avicel-Überlagerung ab oder aspirieren Sie sie und fixieren Sie die Zellen mit der 10 %igen Formaldehydlösung für 30 Minuten bis über Nacht (<1 ml pro Vertiefung für eine 6-Loch-Platte).
   1. Bei Agarose oder CMC die Formaldehydlösung direkt zur Überlagerung hinzufügen und für 1 Stunde bis über Nacht einwirken lassen.
      HINWEIS: Die Proben können über längere Zeiträume in der Fixierlösung aufbewahrt werden, sofern diese nicht verdunstet und austrocknet, da dies die Monolayer verzerren könnte.
2. Vor der Färbung und nach der Fixierung die Formaldehyllösung entfernen und die halbfesten Plugs von Agarose und CMC entweder mit fließendem Wasser oder manuell mit einem Spatel entfernen. Avicel-Plaques mit Wasser spülen, um Reste der Überlagerung bzw. Fixierlösung vor der Färbung zu entfernen.
3. Zur Färbung die Zellen mit einer geringen Menge an Kristallviolett-Lösung für etwa 15 Minuten bedecken. Gegebenenfalls die Platten schwenken, um eine gleichmäßige Benetzung sicherzustellen.
4. Die Kristallviolett-Färbung vorsichtig mit Wasser abwaschen. Nach Fixierung, Färbung und Trocknung können die Plaques unbegrenzt zur späteren Analyse aufbewahrt werden.

Tabelle 1. Inokulationsbedingungen und Zelltypen für den Plaque-Assay

	RVFV	VEEV	Influenza B
Zelltyp	Vero	Vero	MDCK
Infektionsdauer	1 hr	1 hr	45 min
Inkubationszeit	3 days	2 days	3 days

 

Tabelle 2. Plaque- und Virus-/Zellwachstumsmedien

	RVFV	VEEV	Influenza B
Zelltyp	Vero	Vero	MDCK
Wachstumstyp	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Plaque-Medium	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin.

2. Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,025 % HEPES, DEAE-Dextran 50 µg/ml.

A. 2x Minimal Essential Media (500 ml), ergänzt mit 5 % FBS (25 ml), 1 % Minimum Essential Aminosäuren (5 ml), 1 % Natriumpyruvat (5 ml), 1 % L-Glutamin (5 ml), 2 % Pen/Strep (10 ml).

B. 2x Minimal Essential Media (500 ml), ergänzt mit 0,2 % Bovinem Serumalbumin, 1 % Minimum Essential Aminosäuren (5 ml), 50 µg/ml, 0,025 % HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK*

*Fügen Sie unmittelbar vor der Zubereitung 1 µl pro 25 ml des 2 µg/ml-Stamms von TPCK-Trypsin zu der Probe hinzu, die Sie für die Mischung mit Agarose zur Plaque-Bildung verwenden werden.

Tabelle 3. Überlagerungen Lagerbestand

	RVFV	VEEV	Influenza B
Zelltyp	Vero	Vero	MDCK
Infektionsdauer	1 hr	1 hr	45 min
Inkubationszeit	3 days	2 days	3 days

 

Tabelle 4. Plattenformate

	6-Loch	12-Loch	96-Loch
Anzahl der Zellen pro Loch	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volumen des Inokulums (μl)	400	200	50
Volumen der Überlagerung (ml)	3	1.5	0.100

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kristallviolett	Sigma Aldritch	C3886-25G
Formaldehydlösung	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Vor der Wiederaufnahme kräftig schütteln >30 min zum Homogenisieren
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxymethylcellulose, Natriumsalz, mittlere Viskosität	Sigma Aldrich	C4888