Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.
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Methodenartikel
Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Imaging ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden, um biologische Prozesse zu überwachen. Insbesondere kann das Vorhandensein von Krebs, Stammzellen, bestimmte Zelltypen, virale Krankheitserreger, Parasiten und Bakterien in Echtzeit innerhalb von lebenden Tieren 1-2 folgen. Die Anwendung des Biolumineszenz-Bildgebung zur Erforschung der Krankheitserreger hat Vorteile gegenüber herkömmlichen Strategien zur Analyse von Infektionen in Tiermodellen 3-4 verglichen. Infektionen können innerhalb der einzelnen Tiere visualisiert im Laufe der Zeit, ohne dass Euthanasie auf die Lage und Menge des Erregers zu bestimmen. Die optische Bildgebung ermöglicht eine umfassende Untersuchung aller Gewebe und Organe, anstatt Probenahme von Seiten bisher bekannten infiziert zu sein. Darüber hinaus kann die Genauigkeit der Impfung in bestimmten Geweben direkt bestimmt werden vor der Durchführung vor Tieren, die erfolglos während des gesamten Experiments wurden geimpft. Variabilität zwischen den Tieren kann kontrolliert werden, da Bildgebung ermöglicht jedes Tier einzeln verfolgt werden. Imaging hat das Potenzial, deutlich reduzieren Tierzahlen notwendig, weil der Fähigkeit, Daten aus zahlreichen Zeitpunkten ohne Probe Gewebe Erreger Last bestimmt 3-4 erhalten.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um Infektionen in lebenden Tieren mit Biolumineszenz-Bildgebung für die rekombinante Bakterienstämme, die Luciferase zu visualisieren. Der Klick Käfer (CBRLuc) und Glühwürmchen-Luciferase (FFluc) nutzen Luciferin als Substrat 5-6. Das Licht von beiden CBRluc und FFluc hervorgebracht hat einen breiten Wellenlängenbereich von 500 nm bis 700 nm, so dass diese Luciferasen ausgezeichnete Reporter für die optische Bildgebung im lebenden Tier-Modellen 7-9. Dies ist vor allem, weil Wellenlängen des Lichts größer als 600 nm erforderlich sind, um die Absorption von Hämoglobin zu vermeiden und damit reisen durch Säugetiergewebe effizient. Luciferase ist genetisch in die Bakterien eingeführt werden, um Licht-Signal 10 zu produzieren. Mäuse sind pulmonale mit Biolumineszenz Bakterien intratracheal zur Überwachung von Infektionen in Echtzeit ermöglichen geimpft. Nach Luciferin Injektion, werden die Bilder aufgenommen mit der IVIS Imaging System. Während der Aufnahme werden die Mäuse mit Isofluran mit einem XGI-8 Gas Anethesia System. Bilder können analysiert zu lokalisieren und zu quantifizieren, die Signalquelle, die die bakterielle Infektion Website (s) und die Zahl repräsentiert, bzw. werden. Nach der Bebilderung wird CFU Bestimmung an homogenisiert Gewebe durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien zu bestätigen. Mehrere Dosen von Bakterien benutzt, um bakterielle Zahlen mit Lumineszenz korreliert. Imaging können genutzt werden um der Pathogenese und Beurteilung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Verbindungen und Impfstoffe studieren.
Protokoll
1. Pulmonale Infektionen durch intratracheale Intubation
- Wiegen Mäusen und, optional, Markierungen können an den Ohren zur einfachen Identifizierung vorgenommen werden.
- Anesthetize die Mäuse mit Ketamin (100 ug pro g Maus Gewicht) und Xylazin (10 ug pro g Maus Gewicht) durch intraperitoneale Impfung.
- Legen Mäuse in Käfigen, bis sie vollständig betäubt. Drücken Sie die Pads von den Füßen in die Pedale treten Reflex zu überprüfen. Mäuse sollte reduziert oder Display keine Reflex-Reaktion.
- Legen Sie die Maus auf die Intubation stehen Liegen auf dem Rücken.
- Fix ein Gummiband um eine Intubation zu stehen und sie dann unte....
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Diskussion
Obwohl die folgenden Protokolle werden in der Regel in qualitativ hochwertige Bilder, ist es wichtig, ein paar wichtige Fragen zu erörtern, um genaue und konsistente Daten aus bildgebenden Verfahren zu erhalten. Lumineszenz Bilder sollten erworben, die haben zählt von 600 bis 60.000, um sicherzustellen, dass das Signal über dem Hintergrund liegt und die Kamera ist nicht gesättigt werden. Wenn das Signal erhalten weniger als 600 der Expositionsbedingungen sollte so eingestellt zählt zu erhöhen. Wenn das Signal erhalten w.......
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Offenlegungen
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Texas A & M University setzen durchgeführt.
Danksagungen
Die Autoren danken der Cirillo Labor Mitglieder für wertvolle Diskussionen und Unterstützung in dieser Studie. Wir danken Dr. Joshua Hill und dem Labor von Dr. James Samuel um Hilfe bei bei den Dreharbeiten zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Grant 48523 von der Bill & Melinda Gates Foundation und gewähren AI47866 von den National Institutes of Health gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Isofluran | VETONE | 501027 | |
| Ketamin | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazin | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal-plus-Lösung | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Katheter (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Führungsdraht | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope mit Spekulum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS-System | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-Gas-Anästhesiesystem | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparente Nasenkegel | Caliper Life Sciences | ||
| Lichtbaffel-Trennwand | Caliper Life Sciences |
Referenzen
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
