Die Eigenblut Injektion Modell der intrazerebralen Blutung bei Mäusen in diesem Protokoll beschriebenen Verwendungen der doppelten Einspritzung Technik, um das Risiko von Blut Reflux bis die Nadel Spur, keine Antikoagulanzien in das Pumpsystem zu minimieren, und eliminiert alle Totraum und erweiterbar Schlauch in das System.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Eigenblut Injection zu Spontane intrazerebrale Blutungen in Mäuse-Modell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung der Pathophysiologie von Verletzungen nach intrazerebraler Blutung (ICH) erfordert ein reproduzierbares Tiermodell. Obwohl ICH 10–15 % aller Schlaganfälle ausmacht, gibt es derzeit keine spezifische wirksame Therapie. Das Autotransplantations-Blutinjektionsmodell bei Mäusen beinhaltet die stereotaktische Injektion von arteriellem Blut in die Basalganglien und imitiert so eine spontane hypertensive Blutung beim Menschen. Die Reaktion auf die Blutung kann dann in vivo untersucht und die neurobehavioralen Defizite quantifiziert werden, wodurch eine Beschreibung der resultierenden Pathologie sowie die Prüfung potenzieller therapeutischer Substanzen ermöglicht wird. Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren verwendet die Doppelinjektionstechnik, um das Risiko eines Blutrückflusses entlang der Nadelbahn zu minimieren, verzichtet auf Antikoagulanzien im Pummsystem und eliminiert sämtliche Toträume sowie dehnbare Schläuche im System.
Protokoll
1. Vorbereitung der Ausrüstung
- Wischen Sie die stereotaktischen Rahmen und die Pumpe mit 75% Ethanol, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren.
- Sterilisieren Hamilton Spritze und Fused-Silica-Nadel.
Hinweis: Wenn chemische Sterilisation verwendet wird, achten Sie darauf, mehrmals in sterilem Wasser spülen vor Gebrauch. - Wischen Sie die Oberfläche von Paraffinwachs Papier mit 75% Ethanol und trocknen lassen.
2. Vorbereitung der Maus für die Injektion
Hinweis: Haben Mäuse geliefert, Ihr Tier Anlage mindestens 7 Tage vor der Operation, damit sie an die neue Umgebung zu gewöhnen und Stress abzubauen.
- Wiegen Sie mit der Maus für die präoperative Ausgangswert.
- Induce Anästhesie mit 30% Sauerstoff, 70% Lachgas und 4% Isofluran, bis nicht mehr auf Schwanz kneifen
- Inject Maus mit Buprenorphin 0.1mg/kg intraperitoneal zur postoperativen Analgesie
- Shave Kopfhaut
- Coat Augen mit einer sterilen Vaseline
- Bereiten Kopfhaut mit betadine x 3 wischt, dann erlauben Kopfhaut zu trocken
- Machen Sie 1 cm Mittellinie sagittal Schnitt der Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Skalpell
Hinweis: Ein großzügiger Schnitt wird vollständige Freilegung des Schädels Sehenswürdigkeiten ermöglichen. - Shave 1 cm von Ventralfläche des Schwanzes ab 1 cm von der Basis und bereiten mit betadine x 3 Tücher
- Bewegen Sie die Maus auf stereotaktischen Rahmen
Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, Maus ist in den Rahmen mit der Oberfläche des Schädels verläuft parallel mit der Basis des Rahmens zu sichern, mit hervorragenden Belichtung Bregma und mindestens 3 mm rechts von Bregma.
3. Intrazerebrale Blutungen Chirurgie
Hinweise: Während der gesamten Operation die Maus narkotisiert mit 30% Sauerstoff, 70% Lachgas und 1-3% Isofluran, kontinuierlich bei 37 ± 0,5 ° C mit einem Thermistor-gesteuerte Heizkissen und überwacht durch rektale Thermometer.
- Bringen Sie sterile 27 g Nadel auf 1 cc Spritze auf dem Rahmen.
- Passen stereotaktischen Arm, bis die Nadel genau über Bregma.
- Passen Sie den Arm so, dass die Nadel ist bei +2,5 mm lateral Bregma und unteren an die Oberfläche des Schädels.
- Manuell drehen Spritze Bohrloch auf der Oberfläche des Schädels zu machen, während leichtem Abwärtsbewegung des Frame-Betreuung nicht vollständig perforieren Schädel.
- Entfernen Sie die Nadel und vollständige Bohrloch manuell mit Spritze / Nadel
Hinweis: Die Vollendung des Bohrloch von Hand ermöglicht die unmittelbare Anerkennung, wenn Sie perforiert die innere Tabelle des Schädels und minimiert das Risiko eines unbeabsichtigten Drücken Nadel in Hirnparenchym haben. - Machen Querinzision am ventralen Schwanz mit sterilen Skalpell und lassen 2-3 große Tropfen des arteriellen Blutes, um auf Paraffin Papier fallen. Dann schnell zu stoppen Blutungen mit Druck mit steriler Gaze.
- Ziehen Sie 17 ul Blut in Hamilton Spritze und Ort Spritze an der Pumpe.
- Passen stereotaktischen Arm Punkt 5 ° nach medial relativ zum vertikalen Achse.
- Sorgfältig stellen stereotaktischen Arm so, dass die Spitze der Nadel ist über das Bohrloch im Schädel und dann untere Nadel 3,5 mm.
- Warten Sie 2 Minuten, dann ziehen Sie die Nadel 0,5 mm (so dass die Spitze ist 3 mm tief)
- 5 Minuten warten, damit das Gehirn um die Nadel wieder zu erweitern und das Risiko zu minimieren Blut siedendem die Nadeleinführung Titel während der Injektion.
- Inject Blut 1 ul / Minute für 7,5 ul.
- 5 Minuten warten, damit anfängliche Blutgerinnung und für das Tissue Verschiebungen auftreten, um Erhebungen in Hirndruck zu minimieren.
- Spritzen Sie die verbleibenden 7,5 l bei 1 ul / Minute
- Lassen Nadel, um im Platz für 25 Minuten bleiben, um für die Blutgerinnung ermöglichen
Hinweis: Die Nichtbeachtung warten für die Blutgerinnung im Blut Rückfluss bis die Nadel Insertionsstelle Ergebnis wird beim Herausziehen der Nadel - Langsam ziehen Sie die Nadel und sofort mit heißem Wasser spülen, um restliche Blut in die Nadel aus Blutgerinnung verhindern und Wiederverwendbarkeit der Nadel.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Rahmen und schließen Sie den Schwanz und die Kopfhaut Einschnitte mit veterinärmedizinischen chirurgischen Klebstoff.
- Schalten Sie Anästhesie.
- Lassen Sie die Maus zu wecken, während sie kontinuierlich mit freiem Zugang zu Nahrung befeuchtet erwärmt.
- Zurück Maus Käfig mit Geschwistern, wenn ganz wach. Legen Sie Nassfutter Pellet am Boden des Käfigs, Tiere in den Zugang zu Nahrungsmitteln zu helfen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Frontalschnitt von Gehirngewebe der Maus 15 Minuten nach ICH Chirurgie. Unmittelbar nach der Tötung des Gehirns für ICH Erfolg auf grobe Inspektion eines koronalen Abschnitt an der Nadel Insertionsstelle beruhte inspiziert. Blutungen, die bis auf die Basis des Gehirns verfolgt, bis die Nadel track Vergangenheit des Corpus Callosum, oder in die Ventrikel wurden als nicht erfolgreich und die Maus wurde aus allen Analysen ausgeschlossen. Insgesamt ICH success lagen 75-85% in 50 Mäuse mit 0% Mortalität.
Abbildung 2. Zylinder Test zeigt links Hemiparese nach rechts Basalganglien ICH. (A) Beispiel Maus hinten nach ICH Chirurgie. Beachten Sie die Platzierung der nur das Recht Vorderbein an der Wand des Zylinders nach links Basalganglien ICH. (B) Graph des Zylinders Test 1 ergibt sich aus Kohorte von Mäusen nach ICH Chirurgie (n = 5) im Vergleich zu den schein (n = 4). Sham-Mäuse hatten alle Verfahren mit Ausnahme von Blut-Injektion (Nadel in Gehirn eingesetzt). Jede Maus wurde in einem 12-cm Durchmesser klare Glaszylinder gelegt und beobachtet seit 20 hinten. Die anfängliche Platzierung der Vorderbeine an der Wand des Zylinders wurde per hinten erzielt. Nachfolgende Bewegungen (z. B. laterale Exploration) wurden nicht gewertet, bis die Maus wieder auf den Boden und die nächste hinten erzielt. Die Lateralität Index wurde berechnet als (# rechte Vorderbein Platzierungen auf der Seite des Zylinders - # linke Vorderbein Platzierungen) / (# rechts + # linke + # beides), wobei 0 zeigten keine forelimb Vorlieben und 1 angegeben nur das Recht forelimb verwendet wurde .
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses chirurgische Modell intrazerebralen Blutungen in Mäusen unter Verwendung autologer Schwanzarterie Blutwerte in ein reproduzierbares Modell der spontanen Basalganglien Blutung. Eine ICH-Modell bei Mäusen hat den Vorteil der Verfügbarkeit von transgenen Tieren zu Pathophysiologie untersuchen, jedoch macht ihre geringe Größe neurochirurgische Verfahren technisch schwieriger als in größeren Tieren.
Die Collagenase-Modell und die Eigenblut Injektion Modell sind zwei etablierte Modelle der ...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des Institut for Translational Medicine and Therapeutics, sowie einer Trainings-Zuschuss aus dem Institut für Medizin und Technik (T32HL007954) an der University of Pennsylvania und der Marlene L. Cohen und Jerome H. Fleisch Scholar Grant an der Finanzierung University of Connecticut Health Center (LHS) und NIH NS-029331 (FAW).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
Stereotaktischen Rahmen für Maus Neurochirurgie (Stölting, 51925)
Mikroinfusion Pumpe und Prozessor (UMP-3 und Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL)
Maus wärmer (Stölting, 50300)
Inhalationsanästhesie Maus Anästhesie (Braintree Scientific, EZ-AF9000)
25 ul gasdicht Borosilikat Hamilton-Spritze mit beschichteten Kolben und ohne Nadel
(Firma Hamilton, Reno, NV, 1702RN Spritze: 765401, Aderendhülse: 30949, spacer: 30946)
Fused-Silica-Nadel geschnitten 2 cm Länge (Hamilton, 17739)
* Hinweis Hamilton Spritze und Fused-Silica-Nadel kann für mehrere Operationen verwendet werden, wenn sterilisiert vor jeder Operation. Diese Materialien sind entscheidend, um zu vermeiden Blutgerinnung.
Sterile OP-Handschuhe
OP-Kittel, Haube und Maske
Betadine
75% Ethanol
sterile 27 g Nadel (single use)
sterile 1 ml-Spritze (single use)
sterile OP-Messer
Cidex
sterilem Wasser
Buprenorphin und Isofluran
steriler Gaze
Paraffin Papier Quadrate
Veterinary chirurgische Kleber (Vetbond, 3M, St. Paul, MN)
Referenzen
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
