Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Summary

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Abstract

Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ist eng mit zeitlichen und räumlichen Regulation von mehreren wichtigen Signalwege gesteuert. Eine der Hürden, die ihr Verständnis hat die verschiedensten Methoden in Korrelation Veränderungen der wichtigsten Signalwege zur Differenzierung Effizienz. Wir beschreiben hier die Verwendung einer Maus embryonale Stammzellen (ES) zellbasierten Assay auf kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Mit Scoring für Contracting embryonalen Körper (EVG) in einer 96-Well-Platte formatieren, können wir schnell zu quantifizieren kardiogenen Effizienz und identifizieren wichtige Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal-Aktivierung in einen zeitlichen Verlauf folgenden spezifischen Modulator Behandlungen. Die wichtigsten hier skizzierte ist nicht die kardiale Induktion allein, begrenzt und kann nach dem Studium vieler anderer Zelllinien eingesetzt werden. Darüber hinaus hat der 96-Well-Format das Potenzial, weiter als einen hohen Durchsatz, automatisierte Tests für die Prüfung von mehr anspruchsvolle experimentelle Hypothesen ermöglichen entwickelt werden.

Protocol

1. Embryonale Body (EB)-Bildung mit 96-Rundboden-Mikrotiterplatten

1. Wachsen Sie mit der Maus ES-Zellen in 10cm-Zellkultur-Platten mit Maus ES-Zell-Medium mit LIF ergänzt.
2. Wenn ES-Zellen bereit für den Einsatz (in der Regel bei 50-70% Konfluenz), entfernen ES Medien und spülen Sie die Zellen einmal mit 5 ml sterilem PBS.
3. Add 2ml 0,05% Trypsin / EDTA zu jeder Platte und inkubieren Platten bei 37 ° C für 3 bis 5 Minuten, Quench Trypsin EDTA mit 3 ml ES-Medien.
4. Transfer-Zellen zu 50ml Falcon-Röhrchen und drehen mit 1000 rpm für 3 Minuten.
5. Überstand entfernen und Zellpellet resuspendieren mit der gewünschten Menge an EB Medien.
6. Zählen Sie die Zellzahl und verdünnten Zellen bis 5 x10 ³ Zellen / ml in EB Medien.
7. Verwenden Sie Mehrkanalpipette zu 100 &mgr; l der EB Medien hinzufügen enthaltenden Zellen in jedes Well der 96 - runde Loch-Mikrotiterplatten.
8. Legen Sie 96 - runde Loch-Mikrotiterplatten in einem Inkubator.

2. Identifizierung der kritischen Zeitfenster der Schlüssel-Signalweg (e) für Kardiogenese

1. Add Modulatoren der spezifische Signalwege und Fahrzeugkontrolle in jedes Well der 96-well Mikrotiterplatten, die ES-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten wie Tag 0, Tag 1, Tag 2, Tag 3 und Tag 4, etc. Die Hälfte der Brunnen in je 96 -Well-Platte (48 Bohrlöcher) sind für jeden ab Zeitpunkt der Behandlung eingesetzt.
2. Waschen Sie die Modulatoren, indem EB Medien für alle 48 Brunnen in verschiedenen Stoppzeit Punkte. Zum Beispiel, um 2 Tage Behandlung von ES-Zellen ab Tag 0 zu erhalten, waschen Modulatoren am Tag 2. Für jede Behandlung länger als 48 Stunden, ändern EB Medien mit frischen Modulatoren ergänzt alle zwei Tage, bis die gewünschte Endzeit Punkte.
3. Untersuchen EB Kontraktion unter dem Mikroskop nach Tag 7. Ergebnis der Brunnen mit Contracting EBs als positive auf Prozentsätze des öffentlichen EBs für jede unterschiedliche Behandlung Zeitverläufe zu bekommen.
4. Die kritischen Zeitpunkte für ES Kardiogenese sind die Zeiträume, in denen der höchste Prozentsatz von Contracting-EBs durch Signalisierung Modulatoren behandelt werden, wenn zur Steuerung des Fahrzeugs im Vergleich enthalten.

3. Überprüfung von Zeitfenstern der Signalisierung für Kardiogenese in EBs aus hängenden Tropfen

1. Bereiten Sie Petrischalen, indem mit 3-4 ml PBS, um Verdunstung zu verhindern.
2. Folgen Sie den Schritten 1,1 ~ 1,5 bis ES-Zellen in 2.5x10 ⁴ Zellen / ml Endzelldichte vorzubereiten.
3. Gießen Zellgemisch in bakterielle Gericht für einfachen Zugang. Mit Mehrkanal-Pipette 20 pl Tropfen (mit etwa 500 Zellen) auf umgekehrte Deckel. Lassen Sie die einzelnen Tröpfchen zu berühren. Im Allgemeinen ein Deckel passen bis zu 80 Tropfen. Klappen Sie den Deckel wieder auf die Schale mit PBS. Einer Inkubationszeit von 24 Stunden oder 48 Stunden zu EB-Bildung in einem Inkubator zu ermöglichen.
4. Waschen Sie die EB aus hängenden Tröpfchen aus jeder Deckel mit 3 ml EB Medien und Pool 2 Deckeln von EBs, um eine neue Petrischale gebildet. Add EB Medien bis zu einem Gesamtvolumen von 10ml.
5. Transfer-EBs in Suspension auf 0,2% Gelatine beschichtete 6-well Platten am Tag 4. In der Regel 30 EBs werden in jede Vertiefung überführt. Add EB Medien, die 2 ml Endvolumen für jeden gut zu bekommen.
6. Inkubieren Signalisierung Modulatoren auf den Zeitraum von 96-Well-Platte Experimenten identifiziert.
7. Beachten Sie die EB Kontraktion unter dem Mikroskop nach Tag 7 und Kardiogenese können weiterhin durch RT-PCR, Immunfärbung und andere, wenn nötig charakterisiert werden.

Discussion

Die hängenden Tropfen Methode hat den herkömmlichen Verfahren zur EB Bildung und In-vitro-Differenzierung verwendet worden. Es ist jedoch mühsam und Grenzen experimentellen Flexibilität durch logistische Belange. Aus dem gleichen Grund werden die Ergebnisse auch schwieriger zu validieren als die Geschicklichkeit des Experimentators ist entscheidend für die erfolgreiche EB Bildung und Manipulation als hängende Tropfen. Eine einfachere Methode ist die EBs in einen Rundkolben 96-Well-Platte als ein einstufiges Verfahren zu bilden. Dieses Format ermöglicht in vitro-Differenzierung zu standardisieren und kann mehr experimentellen Bedingungen durch die Leichtigkeit des EB Bildung und nachgelagerten Manipulation (zB Modulator Hinzufügen oder Entfernen) unterzubringen. Darüber hinaus kann die 96-Well-Platten-Format optimiert, um eine effiziente Screening-Instrument in Maus-ES-Zellen werden.

Materials