Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Zusammenfassung

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Zusammenfassung

Die Analyse der Lipid-Protein-Wechselwirkung ist schwierig, da Lipide in Zellmembranen eingebettet sind und somit nicht zugänglich sind, die meisten Reinigungsverfahren. Als Alternative können Lipide auf flachen Oberflächen beschichtet werden, wie für die Lipid-ELISA und Plasmon-Resonanz-Spektroskopie eingesetzt. Allerdings tun Oberflächenbeschichtung Lipide bilden keine Mikrodomänenstruktur Strukturen, die möglicherweise für die Lipid-bindenden Eigenschaften wichtig. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht für die Reinigung von größeren Mengen an Proteinen Bindung an ihr Ziel Lipide ermöglichen.

Zur Überwindung dieser Grenzen testen Lipid-Protein-Interaktions-und Lipid-bindende Proteine ​​zu reinigen entwickelten wir eine neuartige Methode bezeichnet Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS). In diesem Verfahren werden Lipidvesikel mit dem Ziel Lipid Phosphatidylserin und als Anker für die Lipid-Annexin V MACS vorbereitet. Phosphatidylserin ist ein allgegenwärtiges Zellmembran Phospholipid, die eine hohe Affinität zum Protein Annexin V. Mit Magnetic Beads konjugiert Annexin V die Phosphatidylserin-enthaltende Lipid-Vesikel werden die magnetischen Kügelchen binden zeigt. Wenn die Lipid-Vesikel mit einer Zelle inkubiert Lysat die Proteinbindung an die Ziel-Lipid wird auch auf die Kügelchen gebunden und kann co-gereinigt werden mittels MACS. Diese Methode kann auch verwendet werden, um zu testen, ob rekombinanten Proteinen rekonstituieren einen Protein-Komplex Bindung an die Ziel-Lipid.

Wir haben diese Methode benutzt, um die Interaktion von atypischen PKC (aPKC) mit den Sphingolipid Ceramid und die Zusammenarbeit zu reinigen Prostata Apoptose Antwort 4 (PAR-4), ein Protein-Bindung an Ceramid-assoziierten aPKC zeigen. Wir haben auch diese Methode für die Wiederherstellung eines Ceramid-assoziierten Komplex von rekombinanten aPKC mit der Zellpolarität-verwandte Proteine ​​Par6 und Cdc42 verwendet. Da Lipidvesikel mit einer Vielzahl von Sphingo-oder Phospholipiden hergestellt werden können, bietet LIMACS eine vielseitige Test für die Lipid-Protein-Wechselwirkung in einer Lipid-Umgebung, die sehr ähnlich ist, dass der Zellmembran. Weitere Lipid-Protein-Komplexe können unter Verwendung Proteomanalyse von Lipid-bindenden Proteins mit der Lipid-Vesikel co-gereinigt werden.

Protokoll

1. Einführung

Die Lipid-Vesikel-vermittelten Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS)-Technik wurde in unserem Labor entwickelt zu isolieren Ceramid-associated Protein-Komplexe ^1-3. Ursprünglich waren die Lipidvesikel von Ceramid und Phosphatidylserin, die für MACS mit magnetischen Partikel-konjugierten Annexin V (hoch affine zu Phosphatidylserin) zu den Vesikeln und deren assoziierten Proteinen zu isolieren erlaubt hat. Wir haben die LIMACS verwendete Technik für die in vitro Rekonstitution eines Ceramid-assoziierten Polarität komplexer und die Isolierung von Ceramid-bindenden Proteinen aus Zelllysaten ^3. LIMACS modifiziert mit anderen Interaktionspartner für die Isolierung der Vesikel (zB Glycolipid-specifc Lektine oder Lipid-Antikörper) sein.

2. Experimentelle Verfahren

Herstellung von Lipid-Vesikel und aPKCBinding Assays

1. Lipidvesikel sind aus getrockneten Mischungen von äquimolaren Mengen von Phosphatidylserin (105 ug) und C16-Ceramid (85 ug) folgende modifizierte Verfahren für große Liposomenzubereitung ^1,4-7 erhalten.
2. Die Lipid-Gemische werden dann resuspendiert und beschallt für 1 h in 100 ul Vesikel Puffer bestehend aus 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl.
3. Nach Zugabe von 300 ul Vesikel-Puffer mit 0,1 mM MnCl ₂ ergänzt, werden die Proben bei 12.000 μ g für 20 min bei 4 ° C zentrifugiert
4. Das Pellet (große Lipidvesikel) ist in 100 ul Vesikel-Puffer resuspendiert und mit 1 nmol Vybrant CM-DII für 1 h bei 37 ° C, um die Vesikelfraktion nach MACS Trennung zu visualisieren. Vybrant CM-DII ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff speziell zur Einbindung in Lipidmembranen.
5. Ein Waschmittel-free Zelllysat wird durch Beschallung / Homogenisierung von Zellen in 300 ul hypotonischen Puffer (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) mit Protease-und Phosphatase-Inhibitoren) durch Entfernung des membranösen Schutt, gefolgt von Zentrifugation vorbereitet. Ein Zentrifugationsschritt bei 100.000 xg für 1 h sollte hinzugefügt werden, um eine Verunreinigung des Zelllysat mit endogenen Membranen, die Phosphatidylserin zu vermeiden.
6. Das geklärte Lysat wird auf die Lipid-Vesikel Suspension zugegeben und das Gemisch wird für 2 h bei 4 ° C inkubiert
7. Das Reaktionsgemisch wird mit 20 ul 20x Annexin V-Bindungspuffer und 50 ul einer Lösung mit magnetischen Beads konjugiert Annexin V ergänzt, gefolgt von Inkubation für 1 h bei 4 ° C.
8. MACS ist nach Angaben des Herstellers (Miltenyi Biotec, Inc.) Protokoll durchgeführt. Das Vorhandensein und die Menge der Lipid-Vesikel wird durch die Überwachung der Vybrant CM-DII Fluoreszenz in den Flow-Through-und Elutionsfraktionen mit einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenz-Reader bestimmt.
9. Die lineare Korrelation zwischen der Höhe der vesikulären Lipid-und Fluoreszenz-Intensität der Vesikel-gebundenem Vybrant CM-DII wird durch quantitative Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) der Lipid-Gemisch aufgetragen, um Annexin V-basierten Macs überprüft.
10. Die Spezifität der Bindungsreaktion aPKC oder andere Proteine, die Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel wird durch einen Antikörper Kompetitionsassay mit 1 ug anti-PKCζ polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das Zelllysat für 1 h bei 4 ° C inkubieren vor der Inkubation mit verifizierten die Lipid-Vesikel.
11. Die Proteinbindung an Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel in der MACS Eluat wird durch SDS-PAGE und Immunoblot analysiert.

In-vitro-Lipid-Protein-Komplex Polarität

1. Die in vitro Rekonstitution eines Lipid-Protein-Polarität Komplex ist nach dem LIMACS Verfahren wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, durchgeführt. In kurzen, Phosphatidylserin (420 ug) und C16-Ceramid (107 ug) wird aus organischen Lösungsmittel getrocknet.
2. Die getrockneten Lipide sind unter Beschallung in 500 ul der Vesikel-Puffer (; 150 mM NaCl 50 mM Tris / HCl, pH 7,5) resuspendiert.
3. Fünf ul 10 mM MnCl 2, 1 ul Vybrant CM-DII, und 500 ng PKCζ (humaner rekombinanter) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch inkubiert undergentle Agitation für 60 min bei 4 ° C.
4. Vybrant CM-DII gebeizt Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel werden durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C wieder
5. Das Pellet (pink) wird in 100 ul Tris-Puffer und ergänzt mit γS-GTP (100 uM), BIP (1 mM), GST-Par6 (100 ng), oder GST-Cdc42 (500 ng) und weitere 3 inkubiert h bei 4 ° C (jede andere Kombination von rekombinanter Proteine ​​von Interesse kann hier eingesetzt werden).
6. Annexin V-Puffer (5 ul einer 20x Stammlösung) und Annexin V-konjugierten magnetischen Beads (50 ul) zugegeben und die Reaktionsmischung unter leichtem Schütteln für weitere 30 min bei 4 ° C inkubiert
7. Annexin V-MACS ist im Anschluss an die Lieferanten-Protokoll wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Elutionsfraktion (1 ml) wird mit 10 pg des reinen Ovalbumin als Niederschlag Hilfe ergänzt. Das Protein wird durch Wessel-Flügge Fällung konzentriert und analysiert SDS-PAGE/immunoblotting wie zuvor ⁸ beschrieben.
8. Die Menge der eluierten Lipidvesikel wird durch den Nachweis von Vybrant CM-DII (rosa) in der organischen (Chloroform / Methanol) Phase des Wessel Flügge Fällungsreaktion quantifiziert. Die Menge an Protein analysiert wird auf gleiche Mengen von Lipidvesikeln normalisiert.

3. Ergebnisse

LIMACS Reinigung von PKCζ-EGFP und die Ceramid-bindende Domäne C20ζ-EGFP

Ein Waschmittel-free Lysat von MDCK-Zellen, die in voller Länge PKCζ C-terminal in Verbindung mit grün fluoreszierende Protein (FLζ-EGFP) oder Ceramid-bindende Domäne in der C-Terminus von PKCζ (C20ζ-EGFP) wurde mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert beschrieben in experimentelle Verfahren. Nach der Elution der MACS-Säule wurde Protein analysiert mittels Immunoblot und Antikörper gegen PKCζ und EGFP für die Detektion der eluierten Protein ^2.

Abbildung 1. LIMACS von EGFP-markierten PKCζ und seine C-terminale Fragment C20ζ mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel.

Waschmittel-free Lysaten von MDCK-Zellen, die EGFP (als eine unverbindliche Regelung), in voller Länge PKCζ-EGFP oder der Ceramid Bindung, C-terminale Fragment C20ζ-EGFP wurden mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben . Nach der Verwendung LIMACS, wurde Protein mit SDS-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE und Immunoblot. Die linke Tafel zeigt, dass EGFP nicht auf die Vesikel mit der Annexin V-linked magnetischen Kügelchen zurückgehalten zu binden. Die mittlere und rechte Bild zeigt die volle Länge PKCζ-EGFP und C20ζ-EGFP wurden durch die Bindung an Ceramid beibehalten.

Diskussion

Um zu testen, die spezifische Interaktion zwischen einem Lipid-und Protein wird durch die Einbettung von Lipiden in der Zellmembran behindert. Die Zellmembran besteht aus einer Mischung von mehreren Lipiden und Proteinen, und es ist in Lipid-Mikrodomänen oder Flöße organisiert. Daher kann die Co-Reinigung von Mikrodomänen und Proteine ​​nicht klar unterscheiden, ob ein Protein direkt bindet an ein Lipid oder nur in einem Mikrodomänenstruktur bereichert. Andere Methoden anhand definierter Lipide auf Oberflächen wie Lipid...

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