Ein Klick-Chemie basierende Methode, die für die schnelle, nichtinvasive und robuste Kennzeichnung von Alkin-markierten Glykane in Zebrafisch-Embryonen erlaubt wird beschrieben. Fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen in den späten Gastrulation Bühne wurden in dieser Studie abgebildet.
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Methodenartikel
Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Imaging Glykane in vivo wurde vor kurzem durch die Verwendung einer bioorthogonale chemischen Reporter, indem man Zellen oder Organismen mit Azid-oder Alkin-markierten Monosacchariden 1, 2. Die modifizierte Monosaccharide, durch die Glykan Biosynthese-Maschinerie verarbeitet, sind in der Zelloberfläche Glycokonjugate eingearbeitet. Die bioorthogonale Azid-oder Alkin-Tags dann eine kovalente Konjugation mit fluoreszierenden Sonden für die Visualisierung oder mit Affinitätssonden zur Anreicherung und glycoproteomic Analyse. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren in der Regel für nicht-invasive Bildgebung von fucosylierte Glykane in Zebrafisch-Embryonen verwendet werden, einschließlich: 1) Mikroinjektion von one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-5-alkynylfucose (BIP-FucAl), 2) Kennzeichnung fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht aus Zebrafisch-Embryos mit Azid-konjugierten Fluorophore über biokompatible Cu (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) und 3) Bildgebung durch konfokale Mikroskopie 3. Die hier beschriebene Methode kann leicht erweitert werden, um andere Klassen von Glykane, zB Glykane mit Sialinsäure 4 und N-Acetyl-5, 6, bei der Entwicklung von Zebrafisch und in anderen Lebewesen zu visualisieren.
Protokoll
1. Egg Collection und Dechorionation
- Sammeln und Transfer Zebrafisch-Eier zu 35mm Petrischale, so viel Wasser wie möglich zu entfernen und fügen Sie dann 1 mg / ml Pronease E in E3 Embryo Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4), um das Chorion zu verdauen.
- Nach 3-5 Minuten verschmelzen die Schüssel in ein Becherglas mit Fisch Wasser (60 mg "Instant Ocean" pro Liter destilliertem H 2 O) gefüllt und sanft Übertragung der Eier in das Becherglas und lassen die Eier zu "stürzen" ins Wasser.
- Spülen Sie die Eier mit Fisch Wasser dreimal. Die meisten Eier wer....
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Diskussion
Imaging Biomolekülen In vivo Liefert wichtige Erkenntnisse ihrer biologischen Aktivitäten in ihrer natürlichen Umgebung. In diesem Video zeigen wir, wie die Kennzeichnung von fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen durch Mikroinjektion one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-FucAl und eine zweite für-Schritt-Fluorophor Konjugation über BTTES-vermittelte biokompatiblen CuAAC realisiert 3. Robust Kennzeichnung kann innerhalb von 2-3 Minuten erreicht werden.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Und Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine; Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health (3U54AI057158-06S1 zu RDS GM093282 zu PW) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| Kupfer (II)-sulfat-Pentahydrat | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 Azid | Invitrogen | A10266 | |
| Dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Natrium-L-Ascorbat | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic Säure | Acros Organics | 164060010 | |
| Glasboden Mikrotiterplatten Gericht | MatTek | P35G-1,5-14-C |
Referenzen
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
