Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

Zusammenfassung

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung, Lüftungs-und Instrumentierung Mauslungen zu stabilisieren oder pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen zu messen, um die Auswirkungen des Blutflusses, Luftstrom-, Atemwegs-Änderungen und Gefäßveränderungen am rechten Ventrikels Nachlast zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die isolierte, belüftet und instrumentiert Mauslunge Vorbereitung ermöglicht gleichmäßige und pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen mit unabhängigen Kontrolle über pulmonale arterielle Strömungsgeschwindigkeit, Durchfluss Wellenform, Atemwegsdruck und linksatrialen Druck gemessen werden. Pulmonalen Gefäßwiderstand basiert auf Multi-Point, stetigem Druck-Flow-Kurven berechnet; pulmonary vascular Impedanz setzt sich aus pulsatile Druck-Flow-Kurven an eine Reihe von Frequenzen, berechnet. Als nun erkannt klinisch wird die Impedanz einer überlegenen Maß rechtsventrikulären Nachlast als Widerstand, weil sie die Wirkungen des vaskulären Compliance, die nicht vernachlässigt werden, vor allem in den Lungenkreislauf umfasst. Drei wichtige Metriken der Impedanz - die Null-Hertz-Impedanz Z _0, die charakteristische Impedanz Z _C, und der Index der Welle Reflexion R _W - geben Einblick in distalen arteriellen Querschnittsfläche für Durchfluss, proximalen arteriellen Steifigkeit und der Upstream-Downstream-Impedanz mismatch jeweils. Alle Ergebnisse in isolierten erhalten, belüftet und perfundierten Lungen sind unabhängig von sympathischen Nervensystems Klangfarbe, Lautstärke-Status und die Auswirkungen der Narkose. Wir haben diese Technik verwendet, um die Auswirkungen von Lungenembolien und chronischer Hypoxie auf Widerstand und Impedanz zu quantifizieren und zwischen den Standorten der Maßnahme (dh proximal vs distal) von vasoaktiven Substanzen und Krankheiten über die Druckabhängigkeit der Z _C unterscheiden. Außerdem, wenn diese Techniken mit den Lungen von gentechnisch veränderten Stämme von Mäusen verwendet werden, können die Auswirkungen der auf molekularer Ebene Defekte auf pulmonary vascular Struktur und Funktion bestimmt werden.

Protokoll

In diesem Protokoll zeigen wir eine isolierte, hinterlüftet, perfundierten Mauslunge Vorbereitung, die zuvor verwendet wurde, um die Auswirkungen von Lungenembolien und chronischer Hypoxie auf pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen (Tuchscherer, Webster, & Chesler, 2006 quantifizieren; Tuchscherer et al ., 2007). In Kürze werden die Mauslungen operativ aus den umliegenden Geweben isoliert, in eine beheizte Kammer (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) und belüftet (Ventilatorische Control Module (VCM)-R mit Timer-Zähler-Modul (TCM); Harvard Apparatus). Die Lunge Gefäßsystem ist mit beheiztem RPMI 1640 Zellkulturmedium mit 3,5% Ficoll mit Hilfe einer Spritzenpumpe (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL), um den stetigen Fluss Wellenformen oder eine hochfrequente oszillierende Pumpe (Bose-Electro Force, Eden generieren perfundierten Prairie, MN) parallel mit der Spritzenpumpe auf pulsatile pulmonary vascular fließen Wellenformen erzeugen. Druckaufnehmer (P75, Harvard Apparatus) messen die momentane Druck der Lungenarterie (PAP) und linksatrialen Druck (LAP). Momentaner Durchfluss (Q) ist mit einem in-line Durchflussmesser (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY) gemessen. Pulsierende Druck-Flow-Beziehungen sind aus diesen Messungen, die Einblick in pulmonary vascular Physiologie und Pathologie und des rechten Ventrikels Nachlast abgeleitet.

1. Ausstattung:

1. Isolierte Lungen-Set-up inklusive Maus Ventilator
2. Datenerfassung und-Computer mit LabView-Programm
3. Zwei Drucksensoren und-Durchflussmesser für Perfusat flow
4. Drucksensoren und-Durchflussmesser (pnemotachometer) zur Sicherung der Atemwege fließen
5. Hochfrequente oszillierende Pumpe und Computer mit Win-Test-Programm
6. Boom / Zoom-Mikroskop, Lampe
7. Heizbad mit hoher Leistung Pumpe für IL-1-System

2. Vorbereiten des IL-1-System

1. Destilliertem Wasser auf 37 ° C durch das Heizbad wird in das Innere des IL-1-System zirkuliert erwärmt.
2. Alle Pumpen, Sensoren und die IL-1 Kanüle werden über saubere Schläuche angeschlossen und alle Schläuche wird mit destilliertem Wasser erhitzt, um 37 ° C gespült Luftblasen, die in die Lunge und verursachen Ödeme reisen konnte, müssen entfernt werden. Tubing von der oszillierenden Strömungspumpe die Durchfluss-Sensor und vom Durchflusssensor der Lungenarterie Kanüle mit 1% PBS gespült.
3. Die P75 Druckaufnehmer werden durch Schließen des Ventils an der Kanüle, öffnen die Ventile in die Atmosphäre und dann schieben die automatische Null-Taste auf der PLUGSYS Verstärker auf Null gestellt. Dann wird das Ventil in die Atmosphäre geschlossen und das Ventil an der Kanüle eröffnet.
4. Die keramischen porösen Stück in die Lüftung Weg der IL-1-System benetzt ist gegen Feuchtigkeit bieten.

3. Lösungen

1. Bereiten Sie 3,5% Vol. Ficoll-RPMI-Lösung und sterile Filter der Medien. Filterung der Medien gewährleistet gibt es keine großen Partikeln, die unbeabsichtigt embolisieren könnte die Lunge. Mit sterilen Medien reduziert auch die Wahrscheinlichkeit eines plötzlichen Ödem entwickeln in der Lunge. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit RPMI für Chirurgie und eine 60 ml Spritze mit RPMI Für jeden experimentellen Studie. Erhitzen Sie das Perfusat in einem 37 ° C Wasserbad.
2. Bereiten Sie 1 ml Heparin 500IU/100g Körpergewicht der Maus (ungefähr). Die Heparin-Salz ist 158IU/mg. Für eine ~ 25 g Maus, mix 1,25 mg Heparin Salz mit 1 ml PBS-Lösung in ein kleines Reaktionsgefäß.

4. Lüften der Maus

1. Nach einer intraperitonealen Injektion von 150 mg Pentobarbital in Lösung pro Kilogramm in die Maus, sicherzustellen, tiefe Narkose, indem Sie einen harten Prise auf eine Pfote. Wenn es keine Reaktion, bereiten Sie die Maus für die Chirurgie durch Pinning seine Vorderpfoten auf die Stabilität corkboard. Hinweis: Während des Experiments Narkosetiefe wird durch genaues Beobachten der Tiere überwacht. Die Stifte in die Pfoten und häufige Schnitte wirken als schädliche Reize, die fehlende Reaktion auf die, dass das Tier in eine chirurgische Ebene der Anästhesie bleibt bestätigt.
2. Sprühen Sie die Brust mit 95% igem Alkohol zu benetzen sich das Fell und die Verwendung gerade Pinzette auf die Haut am Hals zu packen. Schneiden Sie ein 1 cm Öffnung in der Haut über den geraden Schere.
3. Nachdem das Innere des Halses ausgesetzt ist, entfernen Sie alle weißen Drüsengewebe und oberflächlichen Muskeln, auf der Suche nach der Speiseröhre und Luftröhre. Isolieren Sie die Speiseröhre und Luftröhre aus Gewebe auf beiden Seiten und nach hinten.
4. Stecken Sie den kleinen gebogenen Pinzette unter der Luftröhre und greifen ein Stück Naht auf der anderen Seite. Ziehen Sie den Faden unter der Luftröhre und Krawatte ein loses Chirurgen Knoten. Ziehen Sie die Naht oder den Bund fürs Leben.
5. Schneiden Sie ein kleines schräg "v" in die Luftröhre mit einer kleinen Schere, schneiden Sie nicht den ganzen Weg durch die Luftröhre. Bewegen Sie den Kork Bord und Maus an den beheizten IL-1-System. Mit den beiden stumpfen Pinzette packen die Trachealkanüle und die Luftröhre unterhalb des "v". Dann schieben Sie die Trachealkanüle in die Trachealkanüleea durch das "v" Öffnung. Ziehen Sie die Naht um Luftröhre und Trachealkanüle mit der Kanüle in der Luftröhre zu sichern. Den Bund fürs Leben.
6. Begin Lüftung (50% Inspiration, 90 Atemzüge / min, mit tiefer Inspiration) mit Raumluft.

5. Perfusion einem belüfteten Maus

5.1. Greifen Sie auf die rechte Herzkammer mit Heparin spritzen

1. Spray Maus Brust mit Alkohol wieder zu re-nassen Fell. Entfernen Sie alle der Haut auf der Brust über die Rippen mit geraden Pinzette und gerade Schere. Cut nach oben entlang des Brustbeins. Heben Sie die Haut auf jeder Seite und dann schneiden Sie die Haut nach der Linie der unteren Rippen.
2. Fassen Sie den Schwertfortsatz am unteren Ende des Brustbeins mit einer Pinzette und schneiden ein Loch in die Membran mit der geraden Schere. Besorgen Sie sich die Membran mit der Pinzette und schneiden Sie es weg von den Rippen.
3. Fassen Sie den Schwertfortsatz wieder mit der Pinzette (linke Hand) und die Kugel-Spitze, abgewinkelte Schere zu zerschneiden dem Brustbein und durch Rippen, man aufpassen, nicht in die Lungen abgeschnitten, verwenden Sie das Herz oder die Blutgefäße (die Kugel-Spitze auf die Schere zu führen you). Es wird Blut sein, aber solange die Schneide der Schere gegen das Brustbein ist, das Herz und die Lunge wird nicht geschnitten werden.
4. Fassen Sie die Rippen auf der linken Seite und schneiden Sie so viel von den Rippen als notwendig, um das Herz freizulegen. Langsam injizieren die rechte Herzkammer mit 0,1 ml Heparin-Lösung. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung von Blutgerinnseln in der Lunge, die endothelialen Zellen schädigen und Perfusion beeinträchtigt. Das Heparin muss gespritzt, während das Herz noch schlägt sein.

5.2. Kanülieren die wichtigsten Lungenarterie

1. Schneiden Sie den Rest der Rippen (links und rechts) mit dem Rücken (gerundet) Ende der Zange vorsichtig nach der Lunge entfernt von der Rippe Wand. Grabbing die Lunge selbst beschädigt die empfindliche Gewebe. Zufälliger Kontakt zwischen den Scheren Tipps und das Lungengewebe wird auch Schäden verursachen.
2. Bewegen Sie das Mikroskop in Platz über Lunge. Schneiden Sie das Drüsen-und Fettgewebe auf dem Herzen. Verwenden Sie die Pinzette, um sie ziehen weg von den Arterien und Venen und dann mit der Feder Schere geschnitten, während das Gewebe unter Spannung.
3. Mit einem anderen stumpfen Satz Pinzette, eine Schaufel von rechts nach von der Spitze des Herzens nach links unter dem linken Vorhof / Ventrikel an der Spitze der Pinzette unter der Aorta und Lungenarterie (PA) zu bekommen. Tun Sie dies sorgfältig sollte es keinen Widerstand gegen die Pinzette werden. Mit stumpfen Pinzette reduziert die Wahrscheinlichkeit einer versehentlichen Punktion der Pulmonalarterie oder Aorta.
4. Sobald der Pinzette Spitze steht unter der Aorta und der PA, greifen ein Stück Faden und durchziehen. Tie eine lose Chirurgen Knoten. Ziehen Sie die Naht oder den Bund fürs Leben.
5. Optional: Verwendung des abgewinkelten Schere, um die untere Hälfte des Körpers zu entfernen. Reduzieren Sie durch die Rippen und die Wirbelsäule, das Schneiden der Aorta und Vena Cava wird eine erhebliche Menge an Blut zum Fließen zu bringen - mit einem Q-Tip zu stillen den Fluss. In einen Plastikbeutel für die Entsorgung.
6. Prime PA Kanüle mit 4 ml aus einer 10 ml Spritze mit RPMI. Überprüfen Sie, dass alle Schläuche frei von Luftblasen ist. Perfusion der Lunge mit destilliertem Wasser oder Blasen in Ödemen führen.
7. Schneiden Sie eine kleine Kerbe in der rechten Herzkammer freien Wand und legen Sie die PA Kanüle, mit dem Ziel nach unten und nach rechts. Die Spitze der Kanüle sichtbar sein soll durch die transparente Wand des PA. Infuse eine kleine Menge RPMI, um Ihren Standort zu bestätigen. Ziehen Sie die Naht um die Kanüle, Aorta und PA und den Bund fürs Leben. Beachten Sie, dass an dieser Stelle der Aorta auch ausgeschaltet, so tatsächliche Perfusion nicht beginnen sollte, bis der linke Vorhof ist kanülierten gebunden.

5.3. Kanülieren den linken Vorhof

1. Cut eine Kerbe in den unteren Teil des linken Ventrikels und inert den linken Vorhof (LA) Kanüle, mit dem Ziel nach oben. Leichter Druck erforderlich sein, um die Mitralklappe in diese Richtung zu öffnen. In der richtigen Stelle, wird die Kanülenspitze durchrutschen und sicher sein, ohne Naht.

5.4. Begin Perfusion

1. Manuelles ziehen RPMI aus der 10 ml Spritze mit 0,3 ml pro Minute, bis RMPI ist offensichtlich in den Abfluss-Schlauch (pink-ish Farbe im Gegensatz zu den klaren PBS). Wenn es keine Strömung in den Abfluss-Schlauch, re-positionieren Sie den LA Kanüle. Wenn kein Abfluss mit Re-Positionierung erreicht werden kann, für ein Leck in der Lungenarterie zu überprüfen. Ein Leck oder Riss in der Lungenarterie kann nicht repariert werden, dies ist Ursache für den Abbruch des Experiments.
2. Schließen Sie eine 60 ml Spritze mit dem PA Kanüle durch den IL-1-System und starten 1ml/min Infusion von Perfusat, Prüfung auf Dichtheit und sicherstellen, dass die Lunge wiederum weiß, was zeigt, dass RPMI ersetzt Blut in die Lunge. Perfundieren mit langsamen Fluss für zwei Minuten.

6. Mess-Pulsatile and Steady Pulmonary Druck-Fluss-Beziehungen

1. Für die pulsatilen Fluss Studien, zuerst die oszillierende Pumpenkolben Verschiebungen beidie gewünschten Werte für jede Frequenz in der WinTest Programm bei früheren Experimenten. Durch die Variabilität in der Lunge Struktur und Mechanik sind die Verschiebungen für jede Maus eingestellt werden. Set stetigen Fluss auf das gewünschte Niveau. Öffnen Sie das Ventil auf die oszillierende Pumpe und starten Sie die Aufnahme von Daten direkt vor der Ausführung der oszillierenden Strömungsprofil (Wintest Programm). Öffnen Sie die Datei und dann das experimentelle Durchfluss (Q) in Excel. Passen Sie die oszillierende Pumpenkolben Verschiebungen bei jeder Frequenz (Wintest Programm), so dass Q max und Q min als erwünscht.
2. Für stetigen Versuche, das Ventil zu schließen, um das Schwingungsverhalten zu pumpen. Wenn dieses Ventil offen gelassen wird, wirkt die oszillierende Pumpe wie ein Kondensator, dämpfend die Änderungen von einem Durchfluss zu einem anderen. Sammeln von Daten für mindestens 10 Sekunden bei jedem Durchfluss, oder bis die PA Druck um nicht mehr als 5% ändern.
3. Für beide pulsatile oder stationäre Durchflussmessungen, alte Lüftung bei einem konstanten Druck vor der Datenerhebung. Fortsetzen Belüftung unmittelbar nach der Datenerhebung.
4. Achten Sie auf RPMI in den Atemwegen Schlauch, dies ist ein Beweis für Ödeme und ist Ursache für den Abbruch des Experiments. Auch lassen Sie sich nicht RPMI erreichen die Atemwege Druck oder Durchfluss-Sensoren, weil es die Wandler beschädigen.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Vertreter Stetige Ergebnisse:

In der isolierten Lunge Set-up der Experimentator hat die Fähigkeit, unabhängig zu steuern nicht nur die Lungen-Q, sondern auch die Atemwegsdruck P _Luft-und linksatrialen Druck LAP. Dies ist vorteilhaft, da Q, P _Luft-und LAP den Lungengefäßen und die daraus resultierenden Druck der Lungenarterie PAP beeinflussen. Ein weiterer Vorteil ist, dass erzielten Ergebnisse unabhängig von der sympathischen Nervensystems Ton ^1, Volume-Status und Anästhesie ² sind.

PAP Änderungen durch stufenförmige Änderungen in Q für feste P _Luft induziert und entweder feste oder variable LAP sind in Abbildung 1 dargestellt. Beachten Sie, dass in den isolierten Lungen-Präparat, das LAP Kanüle wird typischerweise mit dem Schlauch, dass das Perfusat leitet in einen Abfallbehälter verbunden. Mit diesem Schlauch vorhanden, ist LAP linear abhängig von Q durch Poiseuille-Strömung. Allerdings kann die Höhe der Steckdose und Abfallbehälter manuell eingestellt werden, um eine konstante, nicht-Null-LAP liefern oder den Schlauch entfernt auf Null LAP, die unabhängig von Q. ist zu ermöglichen

Vertreter Pulsatile Ergebnisse:

Während willkürliche pulsatilen Fluss Wellenformen mit diesem System erzeugt werden kann, wir erzeugen typischerweise Fluss der Form Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min bei Frequenzen von f = 1, 2, 5, 10, 15 und 20 Hz zu beurteilen, die linearisierte Impedanz der Lungengefäße (Abbildung 2: oberes Feld). Aus dem resultierenden PAP, LAP und Q-Messungen sind pulmonale Gefäßwiderstand Größenordnung (Z) und Phase (θ), indem Sie zuerst zersetzt eine volle sinusförmige Zyklus von AP = PAP-LAP und Q bei jedem auferlegt sinusförmige Durchfluss Frequenz in eine Reihe von berechneten sinusförmigen Oberwellen mit einer Fourier-Transformation. Das Verhältnis der Druck verwandeln zu fließen verwandeln Erträge der pulmonalen vascualar Impedanz, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), die Größe Z und Phase θ hat. Eingangsimpedanz Z _0, Wellenwiderstand Z _C, und der Index der Welle Reflexion R _W, sind von der Impedanz Größenordnung berechnet. Insbesondere ist Z ₀ von Z an der 0. Oberwelle (f = 0 Hz) berechnet, gemittelt über alle Frequenzen, Z _C als Mittelwert von Z zwischen dem ersten Minimum (5 Hz) und 20 Hz berechnet wird, und R _W berechnet als (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Abbildung 1 Stationäre Strömung Wellenformen (obere Reihe) und die daraus resultierenden Belastungen. (Zweite Reihe: PAP, P _Luft, LAP) als Funktion der Zeit mit verschiedenen Kombinationen von LAP und P _Luft. Die untere Reihe zeigt PAP vs Q. In (A) und (B), LAP steigt und sinkt mit Q, weil der Abfluss-Schlauch vorhanden war. Dieser Schlauch wurde für (C), so dass LAP ist konstant und unabhängig von Q. In (D) und (E) die Höhe der Ablaufschlauch wurde manuell so, dass LAP höher ist, sondern unabhängig von Q. P _Luft eingestellt wurde entweder bei entfernt end-inspiratorischen (A, C, D) oder endexspiratorischen (B, E) Druck.

Abbildung 2 pulsatilen Fluss Wellenform Q (oben) und die daraus resultierenden Druck (unten: PAP, LAP und P _Luft). Als Funktion der Zeit. Aus diesen pulsatile pulmonale Druck-Fluss-Beziehungen kann PVZ berechnet werden, gibt die Gesamtzahl rechtsventrikulären Nachlast.

Diskussion

Kritische Schritte in der Chirurgie

Es ist wichtig, dass darauf geachtet wird beim Schneiden der Brustkorb von der Lunge. Die Lunge muss vollständig freigelegt werden und ungehemmt beim Aufblasen durch das umgebende Gewebe, aber nicht während des Prozesses der Isolierung beschädigt. Die Verwendung eines flachen Gegenstand wie das hintere Ende der Zange können verwendet werden, um die Lunge weg zu halten von der Brustwand, so dass es einen klaren Weg für die Schere geschnitten werden. Ein weiter...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml Spritze	Fisher Scientific	14-829-10F
10 ml Spritze	Fisher Scientific	14-823-2A
60 ml Spritze	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI mit GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Flaschenfilter	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Heparin	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Winkelkugel-Irisschere	Fine Science Tools	14109-09
Vannas Federschere - 4mm	Klingen Fine Science Tools	15018-10
Feine Irisschere - gerade	Fine Science Tools	14106-09
Dumont #5/45 Pinzetten	Fine Science Tools	11251-35
Dumont Medical Biology Pinzetten	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Vergleichbar mit Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Isoliertes perfundiertes Maus-Lungensystem	Harvard Apparatus	739904
Blutdruckmessumformer P75 für PLUGSYS Modul	Harvard Apparatur	730020
TS410 Durchflussmodule	Transsonic	TS410
ME 4 PXN Präzisions-PXN Inline-Durchflusssensoren	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer Multi-Spritzenpumpen	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Fläschchen	Amatheon