Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Summary

A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento e

Abstract

Câncer epitelial de ovário é a principal causa de mortalidade por câncer do sexo feminino nos Estados Unidos. Em contraste com outras mulheres específicos cânceres, como de mama e carcinomas uterinos, onde as taxas de mortalidade têm caído nos últimos anos, as taxas de cura do câncer de ovário têm permanecido relativamente inalterado ao longo das duas últimas décadas ^1. Isto é principalmente devido à falta de instrumentos de triagem apropriados para a detecção da doença fase inicial onde a cirurgia ea quimioterapia são mais eficazes ^{2, 3.} Como resultado, a maioria dos pacientes apresentam doença em estágio avançado e envolvimento abdominal difusa. Isto é ainda mais complicada pelo fato de que o câncer de ovário é uma doença heterogênea com múltiplas subtipos histológicos ^{4, 5.} Carcinoma de ovário seroso (SOC) é o subtipo mais comum e agressivo ea forma mais frequentemente associado com mutações nos genes BRCA. Atuais modelos experimentais neste campo envolvem o uso de linhas de células cancerígenas e os modelos de mouse para melhor compreender os acontecimentos de iniciar genética e patogênese da doença ^{6, 7.} Recentemente, a trompa de Falópio surgiu como um site da novela para a origem da SOC, com a trompa de falópio (FT) célula secretora do epitélio (FTSEC) como o celular proposta de origem ^{8, 9.} Actualmente não há linhas de células ou de sistemas de acesso à cultura a estudar o epitélio FT ou o FTSEC. Aqui nós descrevemos um romance ex sistema de cultura in vivo, onde células primárias de humanos FT epiteliais são cultivadas de forma que preserva sua arquitetura, polaridade, imunofenótipo e resposta a estressores fisiológicos e genotóxicos. Este modelo ex vivo fornece uma ferramenta útil para o estudo da SOC, permitindo uma melhor compreensão sobre como os tumores podem surgir a partir deste tecido, e os mecanismos envolvidos na iniciação e progressão tumoral.

Protocol

1. Preparação de colágeno e Coating Filter.

1. Para preparar o colágeno da placenta humana, tweeze out 30 mg de colágeno da placenta humana e colocou em cima de 50 ml de água destilada (dH ₂ O) em um copo de 500 ml com barra de agitação.
2. Adicionar 100 μls de ácido acético glacial diretamente sobre o colágeno para torná-lo mais fácil de dissolver. Quente a 37 ° C e mexa para dissolver o colágeno. Deve dissolver em 20-30 minutos. Se fios de colágeno permanecem em solução, a esterilização do filtro será difícil.
3. Diluir o estoque de 50 ml com 450 ml de dH ₂ O e filtro-esterilize com uma membrana M 0,2. Esta é a solução final de trabalho. Armazenar a 4 ° C.
4. Prepare membranas Transwell filtrar por revesti-los com colágeno (50-100 mL) durante a noite. Colágeno refrigerados devem ser aquecidos para RT e então adicionado ao compartimento superior para cobrir a membrana durante a noite e em temperatura ambiente. Antes de revestimento do tubo primário dissociada falópio (FT) epitélio (ver abaixo) para os filtros Transwell, lavar os filtros de três vezes em solução salina tamponada com fosfato de 1X (PBS), pelo menos, uma hora antes do uso para remover o excesso de colágeno.

2. Coleta de Tecidos e dissociação.

1. Trompa de Falópio fresco (FT) fimbria deve ser coletado em 1X PBS estéril em um tubo de centrífuga de 50 ml e mantidos em gelo antes da prompt de processamento em uma capa estéreis de cultura de tecidos.
2. Lavar a amostra de tecido vez em 20 ml refrigerados 1X PBS (se a amostra foi coletada em outro tipo de mídia ou é lavar com sangue, pelo menos, 3X para se livrar de tanto sangue e meios de comunicação estrangeiros quanto possível, como isso poderia interferir com a eficiência plating).
3. Usando FT transferência estéril pinças para a 10 centímetros placa de cultura de tecidos com um pouco de PBS e, usando uma pinça estéril bisturi e estéril, cortado longitudinalmente para maximizar a exposição das células epiteliais. Abrir a fimbria de modo que não é mais um tubo, mas uma folha de quase plana de tecido. Em seguida, corte em pedaços menores, mas ainda recuperável (cerca de 3 mm de diâmetro).
4. Transferência de peças para 45 ml de refrigerados dissociação media (MEM contendo 1,4 pronase mg / ml e 0,1 mg / ml DNAse) em um tubo de 50 ml.
5. Rocha suavemente a 4 ° C por 24 a 72 horas. (A partir da experiência, 48 horas é o ideal). Para verificar a quantidade de dissociação, coloque uma gota de dissociação de mídia em um slide e verificar quantidade de aglutinação e viabilidade do tecido (batendo células ciliadas). Você quer ver ambas as células individuais e alguns pequenos aglomerados.

3. Plating trompa de Falópio.

1. Quando a quantidade de dissociação das células epiteliais é a ideal, inativar os meios de comunicação, adicionando volume 10% do FBS. Inverter algumas vezes para desalojar a suspensão de células em agregados menores.
2. Permitir aglomerações de tecido grosso (tecido do estroma) para assentar no fundo do tubo. Remova a mídia contendo células epiteliais em um tubo ml segundo 50.
3. Adicionar 50 ml de MEM frio (sem FBS) ao tubo original 50 ml. Inverter para coletar células adicionais. Coletar mídia em um tubo de 50 ml terceiro (se a amostra é muito grande e um elevado número de células é esperado, este passo pode ser repetido para maximizar a coleta de células). Os grandes pedaços de tecido do estroma / extracelular agora pode ser descartado. Você tem agora duas tubos de 50 ml de suspensão de células. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos e mídia aspirar a dissociação de pellets de células.
4. Ressuspender em cerca de 5-10 ml de USG media (DMEM: F12 suplementado com USG 2% e 1% Pen Strep) aquecido a 37 ° C. Pipeta suavemente. Tenha cuidado para não pipetar muito vigorosamente, pois isso pode danificar as células epiteliais e reduzir a qualidade das culturas. Deve haver uma única célula e pequenos aglomerados (Figura 1).
5. Transferir para placas de cultura de Primaria e incubar por um mínimo de 1 hora ou até 3 horas. Fibroblastos e células vermelhas do sangue vai ficar com o plástico, mas as células epiteliais FT não. Dê uma olhada na placa depois de uma hora para ver se algo está furando. A presença de células ciliadas pode ser visto observando-se o bater dos cílios.
6. Durante esta incubação, filtros de colágeno revestido pode ser lavado e preparado para revestimento de células (Veja o passo 1.4)
7. Depois de 1-3 horas de incubação nas placas Primaria, transferir a suspensão celular a um tubo de 15 ml e lavar o prato Primaria com 5 ml USG mídia, essa mídia de transferência para o tubo para fazer um volume final de 15 ml. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos.
8. Aspirar cuidadosamente meios de comunicação e não perturbar o pellet celular. A julgar pelo tamanho da pelota, ressuspender na quantidade adequada de USG mídia. (Geralmente entre 1-3 ml) Menos é melhor no início para que você possa diluir ainda mais se você precisar. Ressuspender suavemente.
9. Adicionar 10 ml de células em suspensão para um hemocitômetro e determinar a densidade celular. Dicas: Você está à procura de células epiteliais que possuem uma membrana celular distintamente escuro e não são colunares. Você também pode contar células ciliadas que são definitivamente em movimento. Células menores que têm uma auréola appearance são células vermelhas do sangue e não deve ser contado. Haverá alguma aglomeração, então você precisa para estimar que em você contagem de células. A meta de plantio é de 1,65 x10 ⁵ células / membrana, ou pelo menos 75% de cobertura de filtro (Figura 1). Se as células são banhados muito pouco, as células não será capaz de formar uma camada completa epiteliais.
10. Adicionar 500 mL da mídia USG para o fundo do poço de uma placa de 24 poços e inserir Transwell. O volume necessário de FT suspensão de células (veja acima) pode ser adicionada em cada membrana, esta é tipicamente 100 ul.
11. Incubar e crescer durante 1-2 dias sem perturbar topo da membrana. Você pode alterar a mídia no lado basal durante aqueles dias, se necessário. Depois de 1-2 dias, você pode lavar cuidadosamente a parte superior com USG mídia e adicionar uma pequena quantidade (50-100 L) de mídia em cima da membrana. É mais fácil determinar a confluência de culturas de células se a mídia é removida do lado apical dos filtros antes de microscopia. O compartimento inferior deve sempre conter meios de comunicação. Uma vez que as culturas são totalmente confluentes (normalmente dentro de 5 dias), o montante de mídia que viaja através dos filtros do basal para os lados apical deve ser insignificante.
12. Troque a mídia basal uma vez a cada dois dias para os primeiros 10 dias. O compartimento inferior deve ter sempre meios de comunicação para manter as células vivas. Uma vez que as células formaram uma camada epitelial apertado (Figuras 1 e 2) elas podem ser usadas em estudos futuros, tais como imunofluorescência (IF) ou imuno-histoquímica (IHQ).

4. Processamento de membrana.

1. Processamento de membrana é dependente do tipo de estudo que será realizada, mas normalmente envolve a remoção do filtro da Transwell insere.
2. Os filtros são normalmente lavadas 3 vezes em 200 mL de 1X PBS antes da remoção.
3. Aspirar PBS de um lado apical e basal dos filtros. Isto deve ser feito um bem de cada vez para evitar que as membranas de secar.
4. Remover a inserção da placa, flip-la de cabeça para baixo e usar um bisturi estéril para cortar ao redor da membrana. Tentar remover a membrana em uma única peça, fazendo cortes retos ao redor da borda da membrana, em vez de arrastar o bisturi ao redor da borda.
5. Use uma pinça para remover o filtro a partir da inserção, mantendo a par de que lado as células estão em. O filtro pode então ser processado para a IF, IHC, etc conforme o caso.
6. Exemplo: para IF estudos, o filtro (após a permeabilização de fixação, bloqueio e incubação com anticorpos adequados, de acordo com a norma procedimentos IF) deve ser colocado sobre uma lâmina, células para cima, Vectashield com DAPI é jogada sobre o filtro e cobertos com um vidro lamela.

5. Resultados representativos:

Os filtros transwell possam ser facilmente removidos para examinar o epitélio ex vivo por ambos os imuno-histoquímica (IHQ) e de imunofluorescência (IF). Utilizando marcadores específicos da linhagem, pode-se imagem e quantificar o secretora (PAX8 positivo) e ciliadas (Sall2 positivo) compartimentos da célula nestas culturas (Figura 3). Além disso, utilizando esses marcadores, pode-se monitorar a forma como cada tipo de célula responde a diferentes estímulos fisiológicos ^10. Este sistema tem sido utilizado para caracterizar as mudanças na phosphoproteome secretome e intracelular do epitélio FT em resposta a diversos estímulos.

Figura 1. Ilustração mostrando como ex vivo culturas são gerados a partir de tecido humano tubo primário de falópio. Tecido trompa de Falópio fimbrial é obtido a partir do centro cirúrgico e picada de gerar pequenos fragmentos ^1, que são lavadas e incubadas com dissociação de mídia para 24-72 horas ^2. Após a dissociação é completa, os fragmentos de tecido são autorizados a se depositar no fundo do tubo de incubação e da mídia contendo as células epiteliais dissociada é colhida ^3. A eficiência de dissociação pode ser monitorado por exame ao microscópio de contraste de fase ^4. As células epiteliais são, então, dissociado cultivadas em placas de Primaria para ajudar a remover fibroblastos e células hematopoiéticas que, invariavelmente, misturados com as células epiteliais ^5. Uma vez que as células não epiteliais são adequadamente removidos, as células epiteliais são semeados em filtros transwell que são revestidos com colágeno placentário humano ^5. Os meios de comunicação é fornecida pela difusão através da transwell de baixo. As culturas são incubadas por 24-48 horas e depois a mídia apical é removida. As culturas ex vivo são então autorizados a crescer por 5-8 dias para formar um gramado, cheio completas sobre os filtros transwell. As culturas ex vivo pode ser mantida de forma viável nesse estado por até 4 semanas. O cartoon ⁵ mostra uma representação da cultura vivo totalmente crescidas ex com um exemplo de um filtro removido da inserção e corado com hematoxylin e eosina (H & E) para demonstrar a polaridade e arquitetura do epitélio ex vivo.

Figura 2. Microscopia de campo claro de culturas FT ex vivo. Inserções Transwell são revestidos com humano poros 0.4μm placentária colágeno são visíveis (a). Células epiteliais FT são cultivadas em inserções de colágeno revestido (b), onde formam uma camada epitelial (c). Alguns detritos é normalmente aderidos às células epiteliais na cultura (indicado por setas), na maioria das vezes para as células ciliadas.

Figura 3. FT ex vivo da cultura de imunofluorescência (IF). Exemplos de SE imagens de culturas vivo ex fixados e corados com anticorpos contra o (a) de secreção (PAX8) e (d) células ciliadas (Sall2) marcadores. DAPI é usado como um controle para a localização de núcleos celulares (azul) (b e e) e do anticorpo fundidas e coloração DAPI também é mostrado (c e f). O número de células depende da duração do tempo as células estão em cultura (PAX8 coloração, 7 dias; Sall2 coloração, 3 dias).

Discussion

A identificação da FT como um site de candidato de origem para o SOC fornece a oportunidade para a pesquisa básica e translacional destinada a decifrar os mecanismos que ligam fatores de risco conhecidos eo processo serosa real cancerígenos. Crítica para isso é o desenvolvimento de sistemas modelo tratável que vai nos permitir começar a testar a hipótese de que o FTSEC é uma célula de origem para pélvica carcinomas serosos. O modelo de cultura ex vivo aqui descrito é um sistema inovador que permite o isolamento e co-cultura de secreção FT primária e células ciliadas de forma que preserva a morfologia e biologia do epitélio FT nativa. Usando este sistema, que recentemente caracterizou a secretome deste epitélio e como o epitélio responde à agressão mecânica e genotóxicos ^10. Ovulação, um importante fator de risco associado a tumorigênese de ovário, é caracterizada por uma combinação de lesão tecidual, mediadores inflamatórios, fatores de crescimento e hormônios ^11. Este sistema poderia ser usado para estudar o efeito de um ambiente sobre a resposta ovulatória e viabilidade de células ciliadas e secretoras. Além disso, o impacto de outros tipos de células (células inflamatórias ou seja) poderia ser examinado para permitir uma melhor compreensão dos eventos que a diferenciação de células da unidade-tipo e os fatores que contribuem para a transformação neoplásica destas células. Modelos similares já foram descritos em outros tecidos onde epitélio polarizado está presente. Por exemplo, em culturas primárias de polarizada epitélio das vias aéreas, o efeito da heregulin no crescimento celular e resposta a lesão celular foi avaliada ^12. Estes tipos de sistemas modelo fornecer uma maneira nova e útil para estudar a iniciação e patogênese dos tumores que surgem a partir de tecidos epiteliais, e isso é de importância crítica em tecidos como o FT, onde não há linhas de células existem atualmente, e onde há um grande necessidade de identificação das vias principais e desenvolvimento de estratégias de tratamento da novela.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution