Summary
Les trompes de Fallope (FT) se profile comme un site alternatif d'origine d'un carcinome ovarien séreux (SOC). Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour l'isolement et
Abstract
Le cancer ovarien épithélial est une cause majeure de mortalité par cancer des femmes aux États-Unis. Contrairement à d'autres femmes les cancers spécifiques, comme la poitrine et les carcinomes de l'utérus, où les taux de mortalité ont diminué ces dernières années, les taux de cancer de l'ovaire guérir sont demeurés relativement inchangés au cours des deux dernières décennies 1. Ceci est largement dû à l'absence d'outils de dépistage appropriés pour la détection de la maladie au stade précoce où la chirurgie et la chimiothérapie sont les plus efficaces 2, 3. En conséquence, la plupart des patients présentent une maladie stade avancé et diffuse l'implication abdominale. Cette situation est encore compliquée par le fait que le cancer de l'ovaire est une maladie hétérogène avec de multiples sous-types histologiques 4, 5. Carcinomes ovariens séreux (SOC) est le sous-type le plus commun et agressif et la forme la plus souvent associée à des mutations dans les gènes BRCA. Courant modèles expérimentaux dans ce domaine impliquent l'utilisation de lignées cellulaires de cancer et de modèles de souris pour mieux comprendre les événements déclencheurs génétique et la pathogenèse de la maladie de 6, 7. Récemment, la trompe de Fallope a émergé comme un nouveau site pour l'origine du SOC, avec la trompe de Fallope (FT) de cellules épithéliales sécrétoires (FTSEC) que la cellule d'origine proposé 8, 9. Il n'y a actuellement aucune des lignées cellulaires ou des systèmes de culture disponibles pour étudier l'épithélium FT ou l'FTSEC. Nous décrivons ici un roman de culture in vivo ex système où les cellules primaires épithéliales humaines FT sont cultivées dans une manière qui préserve leur architecture, de la polarité, immunophénotype, et la réponse au stress physiologique et génotoxiques. Ce modèle ex vivo fournit un outil utile pour l'étude de la SOC, permettant une meilleure compréhension de la façon dont les tumeurs peuvent survenir à partir de ce tissu, et les mécanismes impliqués dans l'initiation et la progression tumorale.
Protocol
1. Préparation de collagène et de revêtement du filtre.
- Pour préparer humaine collagène placentaire, tweeze à 30 mg de collagène placentaire humaine et de mettre sur le dessus de 50 ml d'eau distillée (dH 2 O) dans un bécher de 500 ml avec un barreau d'agitation.
- Ajouter 100 μls d'acide acétique glacial directement sur le collagène pour le rendre plus facile à dissoudre. Chaude à 37 ° C et remuer pour dissoudre le collagène. Il devrait se dissoudre dans les 20-30 minutes. Si brins de collagène restent en solution, la stérilisation du filtre sera difficile.
- Diluer le stock de 50 ml avec 450 ml de dH 2 O et filtre stériliser avec une membrane de 0,2 um. C'est la solution de travail final. Conserver à 4 ° C.
- Préparer membranes Transwell filtre en les enduisant de collagène (50-100 ul) pendant la nuit. Collagène réfrigérée doit être réchauffé à la température ambiante et ensuite ajouté à le compartiment supérieur pour couvrir la membrane pendant la nuit et à la température ambiante. Avant de plaquer les dissocier tube primaire de Fallope (FT) épithélium (voir ci-dessous) sur les filtres Transwell, se laver les filtres à trois reprises en phosphate de 1X saline tamponnée (PBS) au moins 1 heure avant de l'utiliser pour enlever l'excès de collagène.
2. Collection de tissus et de dissociation.
- Frais des trompes de Fallope (FT) fimbria doivent être collectés dans stérile PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml et conservés sur la glace avant le traitement rapide dans une hotte de culture de tissus stériles.
- Laver l'échantillon de tissu une fois dans 20 ml de PBS 1X froid (si l'échantillon a été recueilli dans un autre type de média ou laver les sanglantes moins 3X pour se débarrasser de beaucoup de sang et que les médias étrangers que possible, car cela pourrait interférer avec l'efficacité placage).
- En utilisant le transfert stériles FT pince à épiler pour un plat de 10 cm de culture de tissu avec un peu de PBS et, en utilisant une pince à épiler scalpel stérile et stérile, coupées longitudinalement pour maximiser l'exposition des cellules épithéliales. Ouvrez le fimbria afin qu'il ne soit plus un tube, mais une feuille presque à plat des tissus. Ensuite, couper en morceaux plus petits mais toujours récupérable (environ 3 mm de diamètre).
- Transfert des morceaux à 45 ml de la dissociation des médias réfrigérée (MEM contenant 1,4 mg / ml pronase et 0,1 mg / ml DNAse) dans un tube de 50 ml.
- Rocher doucement à 4 ° C pendant 24 à 72 heures. (À partir de l'expérience, de 48 heures est optimal). Pour vérifier la quantité de dissociation, mettre une goutte de dissociation des médias sur une lame et vérifiez le montant de l'agglutination et la viabilité des tissus (cellules ciliées battre). Vous voulez voir à la fois des cellules individuelles et quelques petites touffes.
3. Placage trompe de Fallope.
- Lorsque le montant de la dissociation des cellules épithéliales est optimale, inactiver les médias en ajoutant 10% du volume de FBS. Inverser à quelques reprises pour déloger les cellules en suspension dans de plus petits agrégats.
- Autoriser des touffes importantes de tissus (tissu stromal) de s'installer dans la partie inférieure du tube. Retirez les médias contenant des cellules épithéliales à un seconde Tube 50 ml.
- Ajouter 50 ml de MEM à froid (sans FBS) à l'original tube de 50 ml. Inverser pour recueillir des cellules supplémentaires. Recueillir des médias dans un troisième tube de 50 ml (si l'échantillon est très grand et un nombre élevé de cellules est prévu, cette étape peut être répétée afin de maximiser la collecte de cellules). Les grands morceaux de tissu stromal / extracellulaire peuvent désormais être mis au rebut. Vous avez maintenant deux tubes de 50 ml de suspension cellulaire. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes et aspirer les médias dissociation de culots cellulaires.
- Remettre en suspension dans environ 5-10 ml de USG médias (DMEM: F12 supplémenté avec 2% USG et Pen 1% Strep) chauffé à 37 ° C. Pipette doucement. Attention à ne pas trop vigoureusement la pipette car cela peut endommager les cellules épithéliales et de réduire la qualité des cultures. Il devrait y avoir des cellules individuelles et de petits amas (figure 1).
- Transfert sur des boîtes de culture Primaria et incuber pendant un minimum de 1 heure ou jusqu'à 3 heures. Les fibroblastes et les globules rouges se coller au plastique, mais les cellules épithéliales FT ne sera pas. Jetez un oeil à la plaque après une heure pour voir si quelque chose est collé. La présence de cellules ciliées peuvent être vus en notant le battement des cils.
- Pendant cette incubation, les filtres revêtues de collagène peuvent être lavés et préparés pour le placage de cellules (voir étape 1.4)
- Après 1-3 heures d'incubation sur les plaques Primaria, le transfert de la suspension de cellules dans un tube de 15 ml et rincer la plaque Primaria avec 5 ml de milieu USG, le transfert de ce média dans le tube pour faire un volume final de 15 ml. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes.
- Aspirer délicatement les médias et éviter de perturber le culot cellulaire. A en juger par la taille de granulés, remettre en suspension dans la quantité appropriée d'USG médias. (Généralement entre 1-3 ml) Moins est mieux dans le début de sorte que vous pouvez diluer davantage si vous avez besoin. Resuspendre délicatement.
- Ajouter 10 ul de cellules en suspension dans un hématimètre et de déterminer la densité cellulaire. Conseils: Vous recherchez des cellules épithéliales qui ont une membrane cellulaire distinctement sombres et sont non-cylindrique. Vous pouvez également compter les cellules ciliées qui sont certainement le déplacement. Les petites cellules qui ont une auréole appearanCE sont les globules rouges et ne doivent pas être comptés. Il y aura quelques grumeaux, vous avez donc besoin d'estimer que dans le nombre de cellules que vous. L'objectif de semis est de 1,65 x10 5 cellules / membrane, ou au moins 75% de couverture du filtre (figure 1). Si les cellules sont plaquées trop peu densément, les cellules ne sera pas en mesure de former une couche complète épithéliales.
- Ajouter 500 ul de la presse USG au fond du puits d'une plaque de 24 puits et insérez Transwell. Le volume nécessaire de suspension cellulaire FT (voir ci-dessus) peuvent ensuite être ajoutés sur chaque membrane, c'est typiquement 100 pi.
- Incuber et croître pendant 1-2 jours sans déranger dessus de la membrane. Vous pouvez modifier le support sur le côté basale pendant ces jours si nécessaire. Après 1-2 jours, vous pouvez rincer soigneusement le dessus avec USG médias et ajouter une petite quantité (50-100 ul) des médias sur le dessus de la membrane. Il est plus facile de déterminer la confluence des cultures de cellules si le support est enlevé de la partie apicale des filtres avant de microscopie. Le compartiment inférieur doit toujours contenir des médias. Une fois que les cultures sont totalement confluentes (normalement dans les 5 jours), le nombre de médias qui se déplace à travers les filtres de la base aux côtés apicale devrait être négligeable.
- Changer les médias basale fois tous les deux jours pour les 10 premiers jours. Le compartiment inférieur doit toujours avoir les médias pour garder les cellules vivantes. Une fois les cellules ont formé une couche serrée épithéliales (figures 1 et 2) ils peuvent être utilisés dans d'autres études, telles que l'immunofluorescence (IF) ou immunohistochimie (IHC).
4. Traitement membrane.
- De traitement membranaire est dépendant du type d'étude qui sera effectuée, mais implique généralement l'enlèvement du filtre des inserts Transwell.
- Les filtres sont généralement lavées 3 fois dans 200 ul de PBS 1X avant l'enlèvement.
- Aspirer PBS du côté apical et basal des filtres. Cela devrait être fait une bien à la fois pour éviter les membranes de sécher.
- Retirer l'insert de la plaque, retournez à l'envers et l'utilisation d'un scalpel stériles pour couper autour de la membrane. Essayez d'enlever la membrane en un seul morceau en faisant des coupes droites sur le bord de membrane, au lieu de glisser le scalpel sur le pourtour.
- Utilisez une pince à épiler pour enlever le filtre de l'insert, garder une trace de quel côté les cellules sont allumés. Le filtre peut ensuite être traitées pour IF, IHC, etc, le cas échéant.
- Exemple: pour si des études, le filtre (après fixation, perméabilisation, le blocage et l'incubation avec les anticorps appropriés, conformément à la norme SI procédures) doivent être placés sur une lame, les cellules vers le haut, Vectashield avec DAPI est tombé sur le filtre et recouvert d'une verre de la lamelle.
5. Les résultats représentatifs:
Les filtres transwell peut être facilement enlevé pour examiner l'épithélium ex vivo par les deux immunohistochimie (IHC) et l'immunofluorescence (IF). En utilisant la lignée des marqueurs spécifiques, on peut d'image et de quantifier la sécrétion (PAX8 positif) et ciliées (Sall2 positif) des compartiments cellulaires dans ces cultures (figure 3). Par ailleurs, l'utilisation de ces marqueurs, on peut surveiller la façon dont chaque type de cellule répond à différents signaux physiologiques 10. Ce système a été utilisé pour caractériser les changements dans les phosphoprotéome sécrétome et intracellulaire de l'épithélium FT en réponse à divers stimuli.
Figure 1. Illustration de la manière dont l'ex vivo cultures sont générées à partir des tissus primaires tube de Fallope humaines. Tissus trompe de Fallope fimbriae est obtenu à partir du bloc opératoire et émincé de générer de petits fragments 1 qui sont lavées et incubées avec la dissociation des médias pendant 24-72 heures 2. Après la dissociation est complète, les fragments de tissus sont autorisés à se déposer au fond du tube d'incubation et les médias contenant les cellules épithéliales dissociées est récolté 3. L'efficacité de la dissociation peuvent être surveillés par un examen au microscope de 4 à contraste de phase. Les cellules épithéliales dissociées sont ensuite cultivées sur des plaques Primaria pour aider à éliminer des fibroblastes et les cellules hématopoïétiques qui, invariablement, mélangés avec les cellules épithéliales 5. Une fois les cellules non épithéliales sont suffisamment retiré, les cellules épithéliales sont ensemencés sur des filtres transwell qui sont revêtus de collagène placentaire humaine 5. Les médias sont fournies par diffusion à travers la transwell d'en bas. Les cultures sont incubées pendant 24-48 heures, puis les médias apicale est enlevé. Les cultures ex vivo sont alors autorisés à croître pendant 5-8 jours pour former un plein complet sur la pelouse filtres transwell. Les cultures ex vivo peut être maintenu dans cet état viable pour un maximum de 4 semaines. La caricature 5 montre une représentation de la culture ex vivo entièrement développé avec un exemple d'un filtre retiré de l'insert et colorées avec hématoxylin et l'éosine (H & E) pour démontrer la polarité et de l'architecture de l'épithélium ex vivo.
Figure 2. Microscopie à champ lumineux des cultures FT ex vivo. Inserts Transwell sont revêtues de placenta humain pores 0.4μm collagène sont visibles (a). Cellules épithéliales FT sont cultivés sur les inserts revêtues de collagène (b), où ils forment une couche épithéliale (c). Certains débris sont normalement observées adhérer aux cellules épithéliales de la culture (indiquées par des flèches), le plus souvent des cellules ciliées.
Figure 3. FT ex vivo la culture immunofluorescence (IF). Exemples de SI images des cultures ex vivo fixées et colorées avec des anticorps contre (a) sécrétoire (PAX8) et (d) des cellules ciliées (Sall2) marqueurs. DAPI est utilisé comme un contrôle pour l'emplacement des noyaux cellulaires (bleu) (B et E) et l'anticorps fusionné et coloration DAPI est également indiqué (C et F). Le nombre de cellules dépend de la longueur de temps les cellules sont en culture (PAX8 coloration, 7 jours; Sall2 coloration, 3 jours).
Discussion
L'identification de la FT comme site candidat d'origine pour SOC offre la possibilité de la recherche fondamentale et translationnelle visant à décrypter les mécanismes reliant les facteurs de risque connus et le processus de réelles séreuse cancérigènes. Critique pour ce est le développement de systèmes de modèle souple qui va nous permettre de commencer à tester l'hypothèse que le FTSEC est une cellule d'origine pour les carcinomes séreux pelvienne. Le modèle ex vivo culture décrit ici est un nouveau système qui permet l'isolement et la co-culture de sécrétion FT primaires et cellules ciliées dans une manière qui préserve la morphologie et la biologie de l'épithélium FT natale. Grâce à ce système, nous avons récemment caractérisé l'sécrétome de cet épithélium et la façon dont l'épithélium répond aux blessures mécaniques et génotoxiques 10. L'ovulation, un facteur de risque majeur associé à la tumorigenèse de l'ovaire, est caractérisée par une combinaison de lésions des tissus, des médiateurs inflammatoires, facteurs de croissance et les hormones 11. Ce système pourrait être utilisé pour étudier l'effet d'un milieu sur la réponse ovulatoire et la viabilité des cellules ciliées et sécrétoires. En outre, l'impact des autres types de cellules (cellules inflammatoires) pourraient être examinés afin de permettre une meilleure compréhension des événements qui animent la cellule de type de différenciation et les facteurs qui contribuent à la transformation néoplasique de ces cellules. Des modèles semblables ont été décrits dans d'autres tissus où l'épithélium polarisé est présent. Par exemple, dans des cultures primaires de polarisation épithélium des voies respiratoires, l'effet de hereguline sur la croissance cellulaire et la réponse aux lésions cellulaires a été évaluée 12. Ces types de systèmes modèles fournissent une manière nouvelle et utile d'étudier l'initiation et la pathogénie des tumeurs qui proviennent de tissus épithéliaux, et cela est d'une importance cruciale dans les tissus tels que le FT où aucune des lignées de cellules existent actuellement, et où il ya une grande nécessité pour l'identification des principales voies et le développement de nouvelles stratégies de traitement.
Disclosures
Dr Drapkin est un consultant pour Novartis Pharmaceuticals. Pas d'autres auteurs déclarer tout conflit d'intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous remercions les professeurs, des boursiers, des résidents et des adjoints au médecin de l'hôpital Brigham and Women, le Département de pathologie pour rendre les tissus disponibles pour ces études. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l'Institut de NIH / National du Cancer (P50 CA105009, CA108748 K08, U01 CA152990), Fonds de recherche en cancer ovarien, La Fondation Mai Kay, Novartis Pharma, Robert et Deborah Premier Fonds, Randi et le cancer ovarien Joel Cutler Fonds de recherche, Marsha Rivkin Fondation - Scholar Award scientifique, l'AACR - George et Patricia Sehl de bourses pour la recherche en génétique du cancer, et la bourse médecin américain de médecine en Israël - Claire et Emmanuel G. Rosenblatt subvention de la Fondation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | |
| Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) |
| Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Primaria culture plates | BD Biosciences | 353802 | |
| 24 well Transwell Permeable supports | Corning | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester |
| MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | |
| Pronase | Roche Group | 11459643001 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Sall2 antibody | Harvard - T. Benjamin Lab | Gift | 1:20 dilution |
| Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
References
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