Vorbereitung der Lebens-Isolated Vertebrate Sehzellen für Fluoreszenz-Imaging

Zusammenfassung

Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca ^{2 +} Oder anderen Faktoren.

Zusammenfassung

In der Retina ist Phototransduktion, die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, durch die Stäbchen und Zapfen Sehzellen ^1-4 durchgeführt. Stäbchen-Photorezeptoren sind für das Sehen zuständig bei schwachem Licht, Kegel in helles Licht. Phototransduktion erfolgt in den äußeren Teil der Sehzellen, ein spezialisiertes Fach, dass eine hohe Konzentration von visuellen Pigment, das primäre Lichtdetektor enthält. Cis-Retinal, die an ein Protein, Opsin - Die visuelle Pigment besteht aus einem Chromophor, 11 zusammengesetzt. Ein Photon durch die visuelle Pigment absorbiert isomerisiert des Chromophors von 11 - cis zu all-trans. Diese Photoisomerisierung führt zu einer Konformationsänderung in die visuelle Pigment, das eine Kaskade von Reaktionen gipfelte in einer Änderung des Membranpotentials, und die Herbeiführung einer Transduktion der Lichtreiz in ein elektrisches Signal auslöst. Die Erholung der Zelle aus Licht Stimulation beinhaltet die Deaktivierung der Zwischenprodukte durch Licht aktiviert, und die Wiederherstellung des Membranpotentials. Ca ^{2 +} moduliert die Aktivität von mehreren der Enzyme in Phototransduktion beteiligt, und seine Konzentration auf Licht Stimulation reduziert. Auf diese Weise Ca ^{2 +} spielt eine wichtige Rolle in der Erholung der Zelle aus Licht Stimulation und seine Anpassung an Hintergrundlicht.

Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Recovery-Prozess ist die Regeneration der visuellen Pigment, während Licht-Erkennung wurde durch die Photoisomerisierung von seinen 11 zerstört - cis Chromophor all-trans ^5-7. Diese Regeneration beginnt mit der Veröffentlichung von all-trans Retinal durch die photoaktivierte Pigment, hinterlässt der Apo-Protein Opsin. Die freigesetzten all-trans-Retinal wird schnell in eine Reaktion unter Verwendung von NADPH zu all-trans-Retinol und Opsin reduziert kombiniert mit frischen 11 - cis-Retinal in die äußere Segment der Sehpigment Reform gebracht. All-trans-Retinol wird dann aus dem äußeren Bereich und in den benachbarten Zellen, die durch den spezialisierten Träger Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) übertragen.

Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Sehzellen kann verwendet werden, um ihre Physiologie und Zellbiologie studieren. Ca ^{2 +-sensitiven} Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, um im Detail zu untersuchen das Zusammenspiel zwischen äußeren Segment Ca ^{2 +} Veränderungen und Antwort zu ^8-12 sowie die Rolle der inneren Segment Ca ^{2 +} Läden in Ca ^{2 +-Homöostase} Licht ^13,14 . Fluoreszierende Farbstoffe können auch zur Messung von Mg ^{2 +-Konzentration} verwendet werden ^15, pH-Wert und als Tracer von wässrigen und Membran Fächer ^16. Schließlich kann die Eigenfluoreszenz von all-trans-Retinol (Vitamin A) verwendet werden, um die Kinetik der Bildung und Entfernung in einzelnen Sehzellen ^17-19 überwachen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Sylgard bedeckten Teller, experimentelle Kammern und Rasierklingen

1. 35 mm Falcon Petrischalen mit Sylgard Elastomer beschichtet sind für die ordnungsgemäße Hacken eines isolierten Netzhaut auf einzelne Sehzellen erhalten benötigt. Das Elastomer wird nach den Anweisungen des Lieferanten und eine kleine Menge in jede Schale gegossen, um dessen Boden mit einer Schicht bedecken vorbereitet. Ersetzen Sie die Antenne deckt nach der Beschichtung und speichern sie. In ein paar Tagen wird das Elastomer aushärtet und die Speisen sind fertig.
2. Isolierte Photorezeptoren müssen auf dem Boden des experimentellen Kammer-Stick, so dass sie im L....

Diskussion

Wenn gesunde isolierten Zellen nicht erhalten werden, liegt das Problem entweder mit der Isolierung oder der Gesundheit der Netzhaut oder mit ihren Hacken. In der Regel nach dem Entfernen der Vorderseite des Auges und der Glaskörper, die Netzhaut leicht hebt das Pigmentepithel. Wenn es nicht zu schälen versuchen Sie ausgehend von der Peripherie der Augenmuschel. Wenn es immer noch schwer zu trennen, ist eine wahrscheinliche Möglichkeit, dass das Tier wurde nicht dunkel-adaptierten für eine angemessene Zeit, oder das rot.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Dunklen Raum (100-150 m 2)
Rote Ampeln 19			Online-Shops
Infrarot-Lichtquellen und Infrarot-Bildbetrachter	FJW Optical Systems, Inc.
Präpariermikroskop 19			Ausgestattet mit Infrarot-Zuschauer
Epifluoreszenzmikroskop in einem lichtdichten Käfig 19 umschlossen
Dissecting Werkzeuge (Scheren, Pinzetten, Messerhalter)	Roboz oder Fine Science Tools
Sylgard Elastomer	Essex (Charlotte, NC)	Sylgard 184 Elastomer-Kit
Poly-L-Ornithin (0,01%)	Sigma-Aldrich	P4957
Poly-L-Lysin (0,1%)	Sigma-Aldrich	P8920	Verdünnen auf 0,01%
Experimentelle Kammern	Warner Instruments (Hamden, CT)	D3512P
Petrischalen, Kunststoffpipetten	Fisher Scientific