Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Summary

Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays werden benutzt, um die Häufigkeit des Tumor-Ausbreitung Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von syngenen Zebrafisch, dass fluoreszenzmarkierten Leukämie und Details, wie zu isolieren und zu verpflanzen diesen Leukämiezellen bei Grenzverdünnung in die Bauchhöhle von erwachsenen Zebrafisch zu entwickeln.

Abstract

Self-Erneuerung Krebszellen sind die einzigen Zelltypen innerhalb eines Tumors, der eine unbegrenzte Fähigkeit, das Tumorwachstum zu fördern, und sind damit als Tumor-Ausbreitung Zellen oder Tumor-initiierende Zellen bezeichnet. Es wird vermutet, dass die Konzentration dieser sich selbst erneuernden Zellen für die Zerstörung wird Tumorprogression Block und stoppen Rückfall, erheblich verbessert Prognose der Patienten ^1. Der häufigste Weg, um die Häufigkeit der Bestimmung selbst erneuernden Zellen innerhalb eines Tumors ist eine Grenzverdünnung Zelltransplantation Assay, in dem Tumorzellen in Empfängertiere bei steigenden Dosen transplantiert werden, der Anteil der Tiere, die Tumoren zu entwickeln wird die Berechnung der Anzahl der sich selbst erneuernden Zellen innerhalb des ursprünglichen Tumors Probe ^{2, 3.} Im Idealfall würde eine große Zahl der Tiere in jeder Grenzverdünnung Experiment verwendet werden, um eine genaue Bestimmung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Zellen. Allerdings sind in großem Maßstab Experimenten mit Mäusen teuer, und die meisten Grenzverdünnung Assays verwenden nur 10-15 Mäuse pro Experiment.

Zebrafische haben Bedeutung als Krebs-Modell gewonnen, zum großen Teil durch ihre einfache genetische Manipulation und die Wirtschaft durch die breit angelegte Erprobung durchgeführt werden können. Darüber hinaus haben die Krebsarten in Zebrafisch-Modell gefunden worden, um genau imitieren ihr Gegenstück menschlicher Erkrankungen ^4. Während es möglich ist, Tumorzellen von einem Fisch zum anderen durch sub-letalen Bestrahlung des Empfängers Tiere, die Regeneration des Immunsystems nach 21 Tagen Transplantation häufig zu Tumorregression ^5. Die jüngste Kreation von syngenen Zebrafisch hat erheblich erleichtert Tumortransplantation Studien ^6-8. Da diese Tiere genetisch identisch sind, transplantiert Tumorzellen einprägen robust in Empfänger Fisch, und das Tumorwachstum kann über längere Zeit überwacht werden. Syngenen Zebrafisch sind ideal für Grenzverdünnung Transplantation Assays in die Tumorzellen müssen nicht um das Wachstum in einem fremden Mikroumgebung, die sich selbst erneuernden Zellen Frequenz ^{9, 10} unterschätzen angepasst werden können. Zusätzlich ein Zelltransplantaten wurden erfolgreich abgeschlossen mit syngenen Zebrafisch ⁸ und mehrere hundert Tiere können einfach und kostengünstig auf einmal transplantiert werden, die beide um eine genauere Schätzung der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz sorgen dienen.

Hier wird eine Methode zum Erstellen primärer, fluoreszenzmarkierten T-Zell akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) in syngenen Zebrafisch und Transplantation dieser Tumoren bei Grenzverdünnung zu erwachsenen Fische selbst erneuernden Zellen Frequenz bestimmen, vorgestellt. Während Leukämie als Beispiel vorgesehen ist, ist dieses Protokoll geeignet, um die Häufigkeit der Tumor-Ausbreitung Zellen mit jeder Krebs-Modell in der Zebrafisch zu bestimmen.

Protocol

1. DNA Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen

1. Linearisieren Rag2: cMyc und Rag2:: GFP ¹¹ DNA-Konstrukte durch Verdauen 10 ug jedes Plasmid mit NotI bei 37 ° C über Nacht.
2. Phenol: Chloroform-Extrakt und Fällung der Plasmide und resuspendieren jeweils in 20 &mgr; l H ₂ O.
3. Bestimmen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie einen 1:1, 1:5 und 1:10 Verdünnung von jeder verdauten Plasmid auf einem 1% Agarosegel mit 20 &mgr; l, 10 &mgr; l und 5μL eines High-Bereich DNA-Leiter. Diese Art der Quantifizierung ist in der Regel genauer als ein Spektrometer zu lesen.
4. Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 60ng/μL in 1M KCl +0.5 x TE für die Injektion in CG1-Dehnungs-(oder andere syngenen Stamm) Zebrafischembryonen mit 30ng/μL Rag2: cMyc + 30ng/μL Rag2:: GFP.
5. Injektionen sollten wie zuvor gezeigt, ^{12, 13} durchgeführt werden. Kurz gesagt, werden männliche und weibliche Zebrafisch in Paarung Kammern der Nacht vor der Injektion gesetzt. Am Tag der Injektion von DNA in die Injektionsnadel geladen wird, ist der Druck, so dass eine Blase mit einem Durchmesser von 50 um ausgestoßen wird (30pg DNA), das von einer Bühne Mikrometer gemessen angepasst. Dann werden Embryonen im Ein-Zell-Stadium injiziert, mit der DNA direkt in die Zelle injiziert, und nicht in den Dotter. Survival of the injiziert CG1 Embryonen und Larven in der Regel arm, und nur 5% der Fische erfolgreich integrieren das Transgen, so> 600 Embryonen injiziert, um sicherzustellen, dass einige Fische Leukämie zu entwickeln.
6. Bewahren Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 ° C, und entfernen Sie die toten Embryonen nach 24 Stunden. Die Tiere werden dann zu großen Tanks bei 5 Tagen des Lebens übertragen und aufgewachsen wie zuvor ¹⁴ beschrieben.

2. Screening für primäre T-ALL in Zebrafisch-Larven

1. Etwa 28 Tage nach der Injektion betäuben Larven Zebrafisch, indem 200 ul der 4ng / m Tricane-S auf 25 mL der Fische System Wasser in einer Petrischale.
2. Untersuchen Sie die Larven für die Entwicklung der T-ALL mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, mit einer 485/20 Anregungswellenlänge und 530/25 Emissionsfilter auf GFP-Fluoreszenz (Abbildung 1) erkennt fluoreszenzmarkierten.
3. Separate Tumor positive Larven von denen, die negativ sind. Negative Larven zu einem späteren Zeitpunkt geprüft werden kann, wenn Tumoren größer geworden sind, um sicherzustellen, dass kein T-ALL positive Fisch verpasst wurden.
4. Monitor-T-ALL positive Fisch mindestens einmal pro Woche mit dem Epifluoreszenzmikroskop, das Tumorwachstum zu verfolgen.

3. Isolierung und Aufreinigung von fluoreszenzmarkierten primären Leukämiezellen

1. Wenn GFP-positive Leukämie-Zellen haben> 50% der Tier überholt, Opfer der Fische durch Zugabe von 1 ml der 4ng/mL Tricane-S in einer Petrischale mit 9 mL Fisch System Wasser.
2. Den Fisch in eine neue Petrischale mit 1 ml 0.9X PBS mit 5% fötalem Rinderserum, um die Zellen Puffer. Mazerat die Fische mit einer Rasierklinge, pipet die Mischung auf große Zellklumpen distanzieren, dann passieren die Zellen durch ein 40 um mesh Sieb in eine 50 ml Tube. Es ist nicht notwendig, alle Gewebe Klumpen in einzelne Zellen zerfallen.
3. Pipet 500μL der Zellen zu einer 4mL Polystyrol Röhre. Add 1μL 1mg/ml Propidiumiodid (PI), die toten Zellen Etikett wird. Vortex, dann halten die Zellen auf Eis.
4. Sacrifice einem Wildtyp-CG1 Fisch, Mazerat und Belastung in der gleichen Weise wie oben zu normalen Zellen, die als Träger für die Tumorzellen dienen während transplant.Add 4mL 5% FBS in 0.9X PBS zu sammeln, um die 50ml Tube für insgesamt Volumen von 5 mL.
5. Zählen Sie die normalen Zellen, zu verdünnen, um 3x10 ⁵ Zellen / ml in 5% FBS in 0.9X PBS, dann pipet 100μL/well einer 96-Well-Platte.
6. Mit einem Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), sort GFP positive, PI negativen Tumorzellen (Abbildung 2A, B) in den 96-Well-Platte mit Blutzellen bei den folgenden Dosierungen: 10 Zellen / Well in 48 Brunnen, 100 Zellen / well in 24 Wells, 1000 Zellen / Well in 12 Brunnen, und 10.000 Zellen / Well in 6 Vertiefungen. Darüber hinaus sollten 10.000 Zellen in einen Brunnen ohne normale Blutzellen sortiert werden, und erneut analysiert mittels FACS, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen (Abbildung 2C) zu beurteilen.

4. Grenzverdünnung Transplantation in erwachsenen Zebrafisch

1. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren der 96-Well-Platte bei 2000xg für 10 Minuten.
2. Entfernen 95μL des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in den verbleibenden 5μL.
3. Halten Sie ein Erwachsener (> 60 Tage alt) syngenen Zebrafisch Bauchseite auf und injizieren die Zellsuspension in die Bauchhöhle mit einem 26G / 2 "Mikro-Spritze. Zebrafische haben nicht zu sein vor der Transplantation betäubt. In der Regel, 45 Fische mit 10 Leukämie-Zellen transplantiert, 20 mit 100 Zellen transplantiert werden, 7 sind mit 1.000 Zellen und 5 Fische transplantiert werden mit 10.000 T-ALL-Zellen transplantiert.

5. Analyse zur Leukämie-initiierende Zellen Frequenz bestimmen

1. Etwa 28 Tage nach der Transplantation, untersuchen die transplantierten Fisch mit einem epifluoresence Mikroskop mit einer 485/20 Anregungswellenlänge und 530/25 Emissionsfilter auf GFP-Fluoreszenz zu erkennen. Notieren Sie die Anzahl der positiven Fisch pro Gesamtzahl der Fische injiziert.
2. Erneut zu prüfen, die Fische alle 14 Tage für bis zu 90 Tage und notieren Sie die Anzahl der positiven Fisch. Wenn ein Tumor-positive Fisch moribund geworden, Opfer des Tieres durch Tricane-S Überdosierung.
3. Geben Sie die Ergebnisse in eine Tabelle, wie in Abbildung 3D gezeigt. Laden Sie die Daten in die Web-basierte ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) statistische Software http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html ^15, die die Häufigkeit des Tumor-positiven und negativen Tieren verwendet bei Jede Transplantation Dosis die Häufigkeit von selbst erneuernden Leukämiezellen in der primären T-ALL zu bestimmen.

6. Repräsentative Ergebnisse:

DNA Mikroinjektion in Embryonen aus syngenen Fisch führt oft zu einer geringen Überlebensrate der injizierten Embryonen, mit <60% der Embryonen überleben über 24 Stunden. Darüber hinaus ist das Überleben der injizierten syngenen Fische in der Regel während Larvalentwicklung Armen, mit oft <20% überlebende für 28 Tage. Es ist daher wichtig, eine große Anzahl von Embryonen zu injizieren, um transgene Fische, die T-ALL entwickeln zu schaffen.

Als Beispiel CG1 Belastung Embryonen wurden mit Rag2 injiziert: cMyc + Rag2:: GFP. Die Transgene in den sich entwickelnden Embryo Zusammenarbeit zu trennen, so dass jede Zelle, die GFP drückt auch ausdrücken cMyc. Die Larven wurden für die primäre T-ALL nach 28 Tagen (Abbildung 1) gezeigt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass etwa 5% der injizierten Fische haben GFP-positive T-Zellen innerhalb ihrer Thymus (Abbildung 1) und 100% dieser Fische Leukämie zu entwickeln, wie die T-Zellen transformiert ¹¹ werden. Während ein kleiner Teil der Zebrafisch eine erweiterte Leukämie, die sehr leicht zu erkennen an Tag 28 wird haben können, die meisten haben nur eine GFP-positive Thymus (Abbildung 1), sollte so Larven einzeln unter hoher Vergrößerung untersucht werden, um sicherzustellen, dass alle positiven Fische sind ausgewählt. GFP-positive T-ALL Zellen> 50% der Tiere zwischen den Tagen 45-70 überholen.

In dem Beispiel zur Verfügung gestellt wurden Zebrafisch bei 65 Tagen des Lebens geopfert, und Leukämie-Zellen wurden isoliert und FACS für Grenzverdünnung Transplantation sortiert. Einzelne Zellen, die Propidiumiodid negativ und GFP-positiv (Abbildung 2) wurden in eine 96-Well-Platte sortiert. Reanalyse wurde auf 10.000 sortierten Zellen durchgeführt, um die Lebensfähigkeit (idealerweise> 95%) und Reinheit zu beurteilen (idealerweise> 92%, Abbildung 2). Transplantierte T Besserwisser in der Regel auftreten, bevor 28 Tage, aber einige Tumoren kann mehr als 60 Tage zu entwickeln. In diesem Beispiel am Tag 28 wurden frühzeitig Tumore als einen Raum der GFP-positiven Zellen in der Nähe der Injektionsstelle (3B) zu sehen, während einige T Besserwisser wurden mehr Fortschritte gemacht, mit erweitert, um die Bauchhöhle (Abbildung 3C) füllen . Daten aus Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays aus drei verschiedenen primären T-Alls sind in Abbildung 3D gezeigt. Für diese Experimente wurden über 220 Tiere transplantiert, die leicht von einer Person innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden. Datenanalyse mit ELDA-Software zeigten, dass im Durchschnitt 1 in 135 T-ALL-Zellen selbst erneuernden wurden Leukämie-Zellen ausbreiten (Abbildung 3E).

Abbildung 1 Zebrafisch-Larven an der Ein-Zell-Stadium mit Lappen injiziert.::-CMyc + Tuch::-eGFP wurden für die primäre Leukämie Wachstum abgeschirmt 28 Tage nach der Injektion. Fisch (*) hatte GFP-positive T-Zellen innerhalb des Thymus; dieser Fisch wird T-ALL entwickeln, wie die T-Zellen transformiert im Laufe der Zeit geworden. Diese Phase ist sehr häufig am Tag 28. Ein Fisch (**) hatten eine fortgeschrittene T-ALL, die in die Weichteile ausgebreitet hat. Die restlichen zwei Fische sind für das Tumorwachstum negativ. Das Bild wurde bei 16-facher Vergrößerung aufgenommen.

Abbildung 2. Fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen wurden aus erkrankten Tieren sortiert und in den Grenzverdünnung Zelltransplantation Assay. Erstens, ein Tor gezogen wurde, um einzelne Zellen (obere linke Seite) wählen, werden dann Propidiumiodid-negativen Zellen ausgewählt (Mitte links). Schließlich wurde ein Tor gezogen, um nur die GFP-positiven Leukämiezellen zur Sortierung (untere linke Tafel) auszuwählen. Sortiert Zellen sollten erneut analysiert werden, um die Lebensfähigkeit und Reinheit vor der Transplantation (rechte Bilder) zu beurteilen.

Abbildung 3. Zebrafisch wurden für Leukämie Wachstum von 28 Tagen nach Transplantation untersucht. Die Fische werden entweder Tumor negAtive (A), haben einen kleinen Tumor wächst an der Injektionsstelle (B), oder einen Verlauf Leukämie (C). Die Bilder wurden in 7-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Gesamtzahl der Leukämie-positive Fisch pro Gesamtzahl der Fisch bei jeder Verdünnung transplantiert wird aufgezeichnet, wie in (D). Die Daten werden in die Web-basierte ELDA-Programm die Anzahl der Berechnung selbst erneuernden Leukämiezellen und die oberen und unteren 95%-Konfidenzintervall (E).

Discussion

Eine wesentliche Stärke der Verwendung von Zebrafisch in der Krebsforschung ist, dass eine große Zahl von Tieren mit relativ geringem Aufwand genutzt werden kann. Dies ist besonders wichtig in Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays, in denen der Anteil der transplantierten Tieren, die Tumoren zu entwickeln, um die Gesamtzahl transplantiert verwendet werden, um Tumor-initiierende Zellen Frequenz zu bestimmen. In dem hier vorgestellten Verfahren sind über 70 Transplantatempfängers Tiere pro Test verwendet und bietet eine genaue Schätzung der Tumor-Ausbreitung Zellzahl. Sowohl die Anzahl der verwendeten Tiere und die Dosen von Tumorzellen transplantiert auf eine bestimmte Krebsart Modell sollte optimiert werden, zum Beispiel, wenn erste Versuche Tumor-initiierende Zellen sind selten zeigen, kann nützlich Transplantation Dosen 100.000, 50.000, 10.000 und 1.000 Zellen pro werden Transplantation.

Syngenen Zebrafisch-Stämme sind nützlich in Grenzverdünnung Analyse. Allerdings sind diese Stämme noch nicht allgemein in allen Laboren verwendet, und einige Zebrafisch Krebs Modelle gibt es nur in allogenen Fisch. Grenzverdünnung zelltransplantationen kann in Wildtyp-Stämmen, die immun Ablation unterzogen haben durchgeführt werden, obwohl der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz von 10 bis 100-fach höher als bei syngenen Zebrafisch wurden ⁸ verwendet berechnet werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Dosen von Zellen für Transplantationen in nicht-immune abgestimmt, bestrahlte Empfänger verwendet werden soll, wie manche Tumorzellen nicht überleben wird Transplantation in eine fremde Mikroumgebung. Darüber hinaus werden viele Tumoren beginnen, nach 21 Tagen, wenn der Empfänger Tier, das Immunsystem erholt sich zurückbilden, so Tiere sollten für das Tumorwachstum alle 7 Tage nach der Transplantation beurteilt werden.

Die hier vorgestellten Methoden eignen sich für den Einsatz mit jedem Zebrafisch Krebs-Modell und wurde bisher noch nicht verwendet, um festzustellen, Tumor-initiierende Zellen Frequenz in den beiden T-Zell akute lymphatische Leukämie ⁸ und einen soliden Tumor-Modell, Rhabdomyosarkom ^16. Diese Tumoren wurden Fluoreszenz durch Co-Injektion von Embryonen mit beiden ein Onkogen und fluoreszierenden Marker markiert, weil die DNA co-trennt, jede Zelle, die das Onkogen wird auch zum Ausdruck des fluoreszierenden Proteins ^17. Während Fluoreszenz wird empfohlen, weil es Verfolgung von Tumorwachstum, ohne die Notwendigkeit, die Tieropfer erleichtert und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, Tumorzellen durch FACS zu isolieren, ist es möglich, Tumorzellen mit Antikörpern gegen Tumor-spezifische Entscheidungsträger Label, um ihre Reinigung zu erleichtern , kann aber Antikörper-Färbung in Zebrafisch erfordern Optimierung.

Schließlich, nachdem die Häufigkeit von Tumor-Zellen propagieren für eine bestimmte Tumorart bestimmt worden ist, ist es möglich, diese Tests verwenden, um die Mechanismen, die ihre Zelle Frequenz regeln zu identifizieren. Zum Beispiel können primäre Tumorzellen mit Bahn spezifische Inhibitoren vor Grenzverdünnung Transplantation oder transplantiert Fische selbst mit Medikamenten verabreicht werden kann, behandelt werden. Darüber hinaus kann die Genetik der Tumoren selbst durch Injektion des one-Zell-Stadium Fisch mit einem Gen von Interesse manipuliert werden, so dass die resultierende primäre Tumoren überexprimieren des Gens. In diesen Experimenten wird keine Auswirkungen auf sich selbst erneuernden Zellen Frequenz im Grenzverdünnung Assays beobachtet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagens	Firma	Catalog Number
NotI Restriktionsenzym	New England Biolabs	R0189
Phenol: Chloroform	EMD Biochemicals	6805-OP
5M KCl	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
High Range DNA-Leiter	Fermentas	R0621
Syngenen Zebrafisch		Referenzen 6-8
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-036
Propidiumiodid	Sigma-Aldrich	P4864
26G / 2 "Mikroliterspritze	Hamilton	80366
40 um Maschenweite Zellsieb	BD Falcon	352340