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1. Inokulation von Tumorzellen in Vogelembryo CAM
- Bereiten Sie Shell-less befruchteten Hühner-Embryonen, wie beschrieben 8.
- Am Tag 9 der Embryonalentwicklung, montieren ein Mikro-Injektor mit einem 18-Gauge-Nadel auf 1 ml-Spritze verbunden. Schneiden Sie ein 5-6 cm Stück Tygon-Schlauch (1 / 32 "Innendurchmesser, 3 / 32" Außendurchmesser, 1 / 32 "Wandstärke) und vorsichtig einführen Fase der Nadel in den Schlauch. Ca. 4-5 cm von Schläuchen sollte erstrecken sich von der Spitze der Nadel (Abbildung 1a).
- Füllen Sie die Spritze und Schlauch mit Zellsuspension. Dann legen Sie eine Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauches und entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen.
- Inject Tag 9 Embryonen (Abb. 1b) im Rahmen einer Dissektion Umfang mit einer Beleuchtung mit 10.000-100.000 Krebszellen als Bolus innerhalb der CAM (Abbildung 1c). Langsam injizieren Zellen und sorgfältig sicherzustellen, dass die Nadel an der richtigen Stelle für die Zellen ist, um eine sichtbare Bolus innerhalb der CAM zu bilden. Zellen, die tropfen auf den CAM-Oberfläche gereinigt mit Kimwipe oder andere Applikator kann.
- Zurück Embryonen befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bei 60% Luftfeuchtigkeit und damit der Tumor nicht wachsen und vaskularisieren (bis zu 7 Tage).
2. Herstellung von Nanopartikeln
- Um fluoreszenzmarkierten CPMV Nanopartikel für die Injektion in den Hühnerembryo vorzubereiten; verdünnen das virale Nanopartikel (synthetisiert, wie in 8 in PBS, pH 7,4, zu einer Konzentration von 100 pg / ml Vortex Mischung vor Gebrauch gut und Zentrifuge für 1 Minute auf jeder zu entfernen. Aggregate. Ultraschallbehandlung kann auch nützlich sein in Abhängigkeit von Konjugaten und den Grad der Aggregation. Stocks von fluoreszenzmarkierten CPMVs sind für mindestens 1 Jahr stabil, wenn sie bei 4 ° C im Dunkeln. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Aktien, indem Sie ein paar Tropfen auf einen Objektträger aus Glas und Prüfung für die Fluoreszenz. Transmission Electron Microscopy (TEM) kann auch verwendet werden um festzustellen, ob die Teilchen intakt geblieben nach der Konjugation werden.
- Kurz gesagt, kann ein Mikrogramm des viralen Nanopartikel (in einem Endvolumen von 2 ul) zu Kupfer beschichteten Gitter hinzugefügt werden. Als Nächstes fügen Sie dem gleichen Volumen von 2% Uranylacetat für 1 Minute bei Elektronenmikroskop (Philips EM 410).
3. Die intravenöse Injektion von fluoreszenzmarkierten virale Nanopartikel
- Am Tag 16, montieren Mikro-Injektor, wie oben beschrieben. Erstellen Sie gewünschte Lautstärke von viralen Nanopartikel durch den Schlauch in die Spritze (> 200 mL). Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen. Legen Sie Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass die Nadel so lange und konische wie möglich (Abbildung 2a) ist. Wenn die Nadel zu stumpf, wird er nicht in der Lage sein zu durchdringen Ektoderm und schlägt fehl, das Schiff eindringt. Wenn die Nadel ist zu scharf, wird die Spitze Zusammenbruch beim Eindringen Gewebe.
- Intravenös injizieren 100 ul 1 mg / ml Fluorescein Dextran (MG 70.000 Da, Invitrogen) in tumortragenden Embryo distal von der gewünschten Stelle sichtbar gemacht werden (Abbildung 3d). Erfolgreiche Kanülierung CAM Vene ist offensichtlich durch die Rodung von Blut in den Pfad der Einspritzmenge (Abb. 2b). Beurteilen vaskuläre Leckage 1 Stunde nach der Injektion.
- Intravenös injizieren 50 ul 1 mg / ml Lösung von CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) oder PEGylierte CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) zu Embryonen, die Tumore mit vaskulärer Leckage distal von der gewünschten Stelle zu visualisiert werden.
- Bild Tumoren sofort und zu jeder Stunde nach der Injektion mit einem Zeiss-Examiner Z1 aufrechten Mikroskop mit einer Yokogawa drehende Scheibe, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera ausgestattet.
4. Echtzeit-Bildgebung intravital
- Zur Montage des Embryos Bildeinheit, eine dünne Schicht von Vakuumfett um den Umfang der Bildgebung Anschluss auf der Unterseite des Deckels des Embryos Bildeinheit und fit mit 18 mm Deckglas auf den Hafen.
- Position des Embryos, so dass das Deckglas wird der gewünschte Bereich für die Bildgebung zu decken. Langsam senken Sie den Deckel, bis das Deckglas macht einfach Kontakt mit dem Embryo, und schrauben Sie den Deckel auf das Gerät, um es in Position zu halten (Abbildung 2c).
- Fügen Sie Wasser erwärmt auf 37 ° C in den Embryo Bildeinheit außerhalb der Schale mit dem Embryo, und dann die gesamte Einheit auf die Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop mit der Innenseite Klimakammer äquilibriert bis 37 ° C.
- Positionieren Sie die Bildeinheit enthält der Embryo unter dem Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2e). Die bildgebende Einheit wird der Embryo in Position zu halten und halten das Blickfeld fixiert, während die Aufnahme von Bildern, so dass für beide dreidimensionalen Z-Stapel und Zeitreihen-Aufnahmen erfasst werden. Wir erfassen und analysieren dreidimensionale Zeitraffer-Bilder mit Perkin Elmer (ehemals Improvisation) Volocity Software-Paket (Abbildung 3a). Erwerben Sie eine hochauflösende dreidimensionale Stapel des Tumors und des umgebenden Gefäße zu visualisieren detailed Strukturanalysen an bestimmten Zeitpunkten. Erwerben Sie dreidimensionale Stapel in regelmäßigen Zeit-Punkte, um detaillierte strukturelle Veränderungen in der Gefäßversorgung des Tumors Karte. Bild Tumoren jede Stunde nach der Injektion.
- Quantifizierung der Aufnahme von viralen Nanopartikel durch die Berechnung der mittleren Alexa Fluor (AF) 647-Signal in ausgewählten Regionen in den Tumor oder in das Stroma (Nicht-Tumor-Bereich) mit Bild Quantifizierung Software wie Volocity (Perkin Elmer). Der Tumor Stroma-Verhältnis wurde durch Division der mittleren AF 647-Signal in den Tumor über die mittlere AF 647-Signal in das Stroma berechnet. Ein Tumor / Stroma-Ratio von größer als 1 zeigt, dass die Nanopartikel wird durch den Tumor entnommen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
In dem hier beschriebenen Beispiel, injizierten wir HT-29 Kolonkarzinomzellen zu einem Bolus etwa 1mm in der Größe innerhalb der CAM von Tag 9 Hühnerembryonen (Abb. 1b). Nach der Impfung wurden die Embryonen für 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden, um ausreichend Tumorwachstum und Gefäßneubildung (Abbildung 1c) zu ermöglichen. Die Embryonen wurden intravenös mit einem niedermolekularen Dextran injiziert, um der Gefäßversorgung von Tumoren zu bestätigen, und die Tumore wurden unter dem Zeiss AxioExaminer Z1 aufrechten Mikroskop (Abbildung 2d) visualisiert.
Nach intravenöser Verabreichung von CPMV-AF 647 oder CPMV-PEG-AF 647-Nanopartikel (Abbildung 3a und b) mit hoher Auflösung in Echtzeit konfokale Bildgebung (Abbildung 2e) ergab, dass sowohl CPMV und CPMV-PEG-Nanopartikeln schnell beschriftet das gesamte Gefäßsystem, aber die Aufnahme von CPMV-PEG durch den Tumor war etwa 3 mal höher als CPMV nach 12 Stunden (Abbildung 3a). Die relative Tumor Aufnahme von Nanopartikeln wurde mit Bildanalyse-Software (Volocity von Perkin Elmer). Regionen von Interesse waren innerhalb und außerhalb der Tumor ausgewählt (im Stroma) und die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen bestimmt. Die Daten werden als Tumor / Stroma-Verhältnis ausgedrückt.
Abbildung 1. Mikroinjektion von Tumoren in den CAM eines Vogelembryo. (A) Die Mikroinjektion Vorrichtung ist aus den Komponenten zusammengesetzt wie angegeben. (B) Vogelembryonen am Tag 9 sind bereit, mit Tumor geimpft werden, wenn die CAM ausgebreitet hat, die gesamte Oberfläche bedeckt. (C) Am Tag 16 wird der Tumor gewachsen sein, bis zu 1 cm im Durchmesser (gestrichelte Linie) und ist bereit für die Injektion mit Nanopartikeln.
Abbildung 2. Nanopartikel-Einspritzung und intravital Bildgebung. Injection unter einem Dissektionsmikroskop zeigt (a) die Spitze des Mikroinjektor Nadel bereit, in die CAM Vene injiziert werden und (b) die Mikroinjektor Nadel in die Vene eingeführt (durch Pfeil gekennzeichnet) und Nanopartikel injiziert in den Blutfluss (gesehen durch das Löschen des Blutes). (C) Imaging-Einheit mit Vogelembryo mit dem Deckglas eine Schnittstelle direkt mit dem CAM. (D) Vor der Nanopartikel-Injektion wird der Gefäßversorgung von Tumoren untersucht mit Hilfe der Intravitalmikroskopie Bildgebung nach der Injektion von Fluorescein Dextran. (E) Imaging-Einheit mit dem Embryo auf der Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop in einem temperierten Gehäuse gesetzt positioniert, um 37 ° C.
Abbildung 3. Intravital Visualisierung von Nanopartikeln Aufnahme in menschlichen Tumoren. Tumoren sind 7 Stunden nach der Injektion von (a) CPMV-AF647 und (b) CPMV-PEG-AF647 visualisiert. d) Exzision des Tumors aus Vogelembryo für die spätere Analyse.