Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

1. Der Bau der Elektroporation Kammer

1. Bestellen Sie ein MicroSlide, BTX-Modell 453 mit einem 3,2 mm Abstand (Harvard Apparatus # 45-0105) (Abb. 2A). Die Metallschienen sollte vollständig auf den unteren Rand der Folie abgedichtet werden.
2. Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug mit einem Griff aus Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen Rack geschnitten. Schneiden Sie den Griff in 5 kleine rechteckige Stücke jeweils mit den folgenden Abmessungen: Länge 0,8 cm, Höhe 0,6 cm, Breite 0,3 cm (Abb. 2B). Diese Kunststoffteile sind wiederverwendbar Abstandshalter, die verwendet werden, um die einzelnen Vertiefungen in der MicroSlide Kammer Schimmel werden.
3. Legen Sie die Kunststoff-Abstandshalter zwischen den Metallschienen des MicroSlide in gleichmäßigen Abständen. Die Abstandshalter sollte eng anliegen (Abb. 2C).
4. Schneiden Sie die Spitze aus einem P200 Pipettenspitze, passen die Spitze auf eine 3ml Spritze, und füllen Sie die Spritze mit 100% Silikon Aquarium Versiegelung. Füllen Sie die Lücken zwischen den Abstandhalter aus Kunststoff mit Dichtmittel. Achten Sie darauf, um die Lücken von unten nach oben, so dass keine Luftblasen zwischen dem Dichtstoff-Stecker und die Basis des MicroSlide Formular ausfüllen.
5. Legen Sie eine Metallstange oben auf dem Abstandhalter aus Kunststoff und befestigen Sie ihn mit Binder Clips, so dass die Abstandshalter vorhanden sind gehalten, während der Dichtstoff trocknet (Abb. 2D-E). Lassen Sie die Versiegelung über Nacht trocknen.
6. Entfernen Sie den Binder Clips, Metallstab und Abstandhalter aus Kunststoff (Abb. 2F). Verwenden Sie ein Skalpell, um die Versiegelung von der Spitze der Metallschienen reinigen. Verwenden Sie ein Binokular auf die MicroSlide zu untersuchen und sicherzustellen, dass keine Blasen an der Unterseite des Silikon-Dämme sind. Entfernen Sie alle Dichtstoff Film, der in den Brunnen, so dass blankes Metall in den Brunnen ausgesetzt ist, gebildet haben. Füllen Sie ein gut mit Wasser und stellen Sie sicher, dass das Wasser nicht weiter in den angrenzenden gut (s). Wiederholen Sie dies für alle Vertiefungen.
7. Die fertigen MicroSlide passt in die Plastikschale mit dem Metall Pole neben dem Fenster in der Seite der Schale (Abb. 2G), die Elektroden wird schließlich auf das Metall Stangen befestigt werden.

2. DNA-Präparation

1. Add Plasmid-DNA zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bringen die Lautstärke bis zu 150 &mgr; l mit destilliertem Wasser. Multiple-Plasmid Arten können für die Zusammenarbeit Elektroporation (z. B. eine experimentelle DsRed konstruieren und eine Kontrolle GFP-Konstrukt) kombiniert werden. Bei der Berechnung der Menge an DNA, um das Rohr hinzuzufügen, bedenken Sie, dass das endgültige Volumen der DNA-Aliquot werden 60μl. Normalerweise ist jedes Konstrukt in einer Endkonzentration von 0.5μg/μl verwendet.
2. Fällung der DNA durch Zugabe von 15μl 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 450μl 100% Ethanol. Umkehren oder tippen Sie auf das Röhrchen mehrmals zu mischen.
3. Spin auf der DNA bei 4 ° C, 13.200 rpm, 30 min. Waschen des Pellets mit 70% Ethanol, dann drehen sie sich wieder bei 4 ° C, 13.200 rpm für 15 Minuten. Der Luft trocknen das Pellet bis semi-transparent, ca. 7 Minuten, dann in 54μl sterilem Wasser resuspendiert. Add 6μl sterile 10X PBS (pH 7,4) und mischen.

3. Eye-Sammlung

1. Sterilisieren der Elektroporation Kammer und alle Instrumente mit 70% Ethanol. Während brauchen Auge Sammlung und Dissektion nicht in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, desinfizieren Sie Ihre Handschuhe und Tischgerät mit Ethanol und versuchen, sterile Bedingungen während des gesamten Verfahrens aufrecht zu erhalten.
2. Bereiten Sie Petrischalen mit Dissektion Medium (1:1-Verhältnis von DMEM: F12, 100U/ml Penicillin, 100μg/ml Streptomycin, 0.29mg/ml L-Glutamin und 5μg/ml Insulin): zwei 35-mm-Gerichte mit jeweils 3ml Medium und eine 60mm Teller mit 6ml Medium. Dieser Schritt sollte in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt werden.
3. Desinfizieren Sie die Kopf-und Hals eines Neugeborenen (postnatalen Tag 0) Maus Welpe mit 70% Ethanol. Schnell mit einer Schere zu enthaupten und den Transfer der Kopf in eine sterile 100mm Schüssel.
4. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere die Augen setzen. Verwenden einer gebogenen Pinzette vorsichtig Schaufel das Auge aus der Augenhöhle, und platzieren Sie das Auge in einer 35mm Schale mit Dissektion Medium. Es kann hilfreich sein, die Augen unter einem Binokular bei geringer Leistung zu entfernen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4, bis alle Augen gesammelt wurden. Halten Sie die Augen in Dissektion Medium bei Raumtemperatur während sezieren. Sie benötigen 3-4 Augen pro DNA Aliquot.

4. Retinal Dissektion

1. Verwenden Sie 70% Ethanol, beide mit einer Rasierklinge und der Wrapper einer sterilen Plastik Transferpipette desinfizieren. Schneiden Sie die Spitze aus der Pipette mit der Klinge, so dass es saugen kann eine ganze Auge. Bewahren Sie die Pipette in die Plastikfolie, wenn nicht in Gebrauch ist.
2. Transfer mit einem Auge aus dem 35mm Teller auf die 60mm Gericht. Unter dem Binokular bei hoher Leistung, verwenden feinen Pinzette zu entfernen irgendein Gewebe, wie Augenmuskeln und Fett von der Oberfläche des Auges. Dann entfernen Sie den Sehnerv durch Kneifen es aus an der Basis.
3. Um die Netzhaut zu isolieren, poke ein kleines Loch in der Sklera am Limbus. Legen Sie einen Stift aus beiden Pinzetten in das Loch (tangential an der Netzhaut) und vorsichtig aufreißen die Lederhaut / RPE. In Albino-Mäuse, erscheinen die Lederhaut und RPE glänzenden bezogen auf die Retina, die eine homogene matte graue Farbe ist. In pigmentierten Mäusen ist die RPE schwarz. Lassen Sie das Objektiv an Stelle.
4. Verwenden Sie die Transferpipette der sezierten Netzhaut in den anderen 35-mm-Schale mit Medium zu bewegen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4,2 bis 4,4, bis alle Augen seziert worden.
6. Shop der Netzhaut in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator, bis Sie bereit elektroporieren sind.

5. Vorbereitung für die Elektroporation

1. Bereiten 35mm Gerichte des Mediums. Für jede DNA Aliquot elektroporiert werden, müssen Sie eine Schüssel Dissektion mittel-und eine Schüssel von Kulturmedium (Dissektion Medium plus 10% FBS). Beschriften Sie die Gerichte entsprechend.
2. Verwenden Sie ein P200 Pipette und sterile 1X PBS zu waschen die Kammern in die Elektroporation Gericht. Jede Kammer hat ein Volumen von 60-100 &mgr;. Waschen Sie jede Kammer dreimal.
3. Füllen Sie die Kammern mit den DNA-Aliquots. Nicht verwendete Kammern sollte mit 60μl 1X PBS gefüllt werden. Verbinden Sie die Elektroden auf die Elektroporation Gericht.
4. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen auf dem Elektroporator: mode, LV, Spannung, 30V; Pulslänge 50 ms; Anzahl der Impulse, 5; Intervall, 950 ms, Polarität, unipolar.

6. Elektroporation

1. Verwenden feinen Pinzette auf die Netzhaut durch die Linse zu erfassen und übertragen sie in die Elektroporation Kammern. Jede Kammer kann bis zu 3-4 Maus Netzhaut (Abb. 3).
2. Verwenden einer Pinzette, um Line-Up der Netzhaut, so dass die Linse gegen die Metallstange an der positiven Elektrode neigt. Reinigen Sie die Zange mit einem Kimwipe nach jedem Transfer zu vermeiden Verschleppung von DNA aus einer Kammer in die nächste.
3. Sobald alle Netzhaut ausgerichtet sind, drücken Sie "Start" auf dem Elektroporator. Tiny Blasen sollten auf der Metallstange an der negativen Elektrode zu bilden.
4. Trennen Sie die Elektroden und schalten Sie den Elektroporator.
5. Verwenden einer Pinzette vorsichtig bewegen die Netzhaut weg von der Kammerwände.
6. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette auf der Netzhaut aus den Kammern Transfer in die 35-mm-Schalen mit Dissektion Medium.
7. Waschen Sie jede Kammer dreimal mit sterilem 1X PBS, dann mit sterilem Wasser spülen. Spray Schüssel mit 70% Ethanol.

7. Platzieren Netzhaut an Filtern für die Kultur

1. Verwenden Sie einen Transfer Pipette auf die Netzhaut in den 35-mm-Schalen mit Nährboden übertragen.
2. Beschriften Sie die Vertiefungen einer sterilen 6-well-Kulturplatte und füllen jedes Well mit 3ml Kulturmedium.
3. Verwenden einer sterilen Pinzette zu runden Whatman Nuclepore Filter, glänzenden Seite nach oben, oben auf dem Medium in jede Vertiefung statt.
4. Unter einem Binokular, eine sterile Transferpipette auf der Netzhaut auf den Filter, Objektiv-side-down zu übertragen. Wenn die Netzhaut landet Objektiv-side-up, es aufnehmen mit der Pipette und versuchen, es wieder Platz. Legen Sie nicht mehr als 4 Netzhaut auf einem Filter, und stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen der umgebenden Mediums jeder Retina getrennt von den anderen Tröpfchen bleiben. Beachten Sie, dass wir die Kultur der Netzhaut mit dem Objektiv intakt, obwohl auch andere Protokolle für die Entfernung der Linse rufen vor diesem Schritt ^{9 fort.}
5. Legen Sie die Kultur Platte in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator (5% CO ₂₎ und wachsen für die gewünschte Menge an Zeit, in der Regel acht Tage. In unserer Erfahrung, wobei das Medium ist nicht notwendig während der 8 Tage Kulturdauer, obwohl ein Mediumwechsel für längere Zeiträume Kultur erforderlich sein kann.

8. Ernte und flatmounting fluoreszierenden Netzhaut Explantate

1. Ersetzen Sie das Kulturmedium in jede Vertiefung mit 4% Paraformaldehyd / 1X PBS. Wenn die Netzhaut, die Filter stecken bleiben, verwenden Sie Zangen, um die Filter umdrehen und vorsichtig schälen die Netzhaut aus dem Filter. Inkubieren in Paraformaldehyd für 30 min. bei Raumtemperatur. Schützen Sie die Netzhaut vor Licht zu vermeiden, Bleichen der Fluoreszenz.
2. Spülen Sie die Netzhaut zweimal für 10 Minuten in 1X PBS.
3. Verwenden Sie ein Einweg-Pipette auf die Netzhaut auf einen Objektträger in einen kleinen Tropfen PBS übertragen. Unter einem fluoreszierenden Präpariermikroskop, verwenden Pinzette auf die Netzhaut Flip, so dass sie elektroporiert-side-up (dh, Objektiv-side-down).
4. Legen Glas "Füße" aus zerstoßenen Deckgläser (Glasscherben ca. 1-2 mm im Durchmesser) an den Ecken der Folie gemacht, diese Füße verhindern Abflachung der Netzhaut. Ein intaktes Deckglas über der Folie, so dass es deckt die Netzhaut und ruht auf den Füßen. Falls erforderlich, eine Pipette, um mehr PBS zwischen dem Schieber und dem Deckglas hinzuzufügen.

9. Imaging und Quantifizierung der Fluoreszenz in Flatmount

1. Verwenden Sie einfluoreszierende Verbindung Mikroskop mit einem Monochrom-Kamera zur Abbildung der flatmounted Netzhaut bei geringer Leistung (4X Objektiv) in die rote und grüne Kanälen ausgestattet. Alle Netzhaut müssen mit der gleichen Belichtungszeit für eine bestimmte fluoreszierende Kanal abgebildet werden zum Vergleich der Fluoreszenzintensitäten zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht in jedem Bild gesättigt, oder genaue Quantifizierung unmöglich sein wird. Export von Bildern in Graustufen TIFF-Format.
2. Öffnen Sie das Bild für eine Netzhaut (dh .., Rot-Kanal und grünen Kanal) in ImageJ-Software (Set http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). Aus Gründen der diesem Tutorial wird das grün fluoreszierende Kanal (GFP-Protein) die Kontrolle zu konstruieren, die konstant in allen Netzhaut in das Experiment. Die rote Fluoreszenz-Kanal (DsRed Protein) ist die experimentelle Konstrukt, das für jeden Satz von Netzhaut unterschiedlich. Die Bilder sollten in Graustufen.
3. In ImageJ, wählen Sie die Kontrolle grünes Image und geben Sie einen Kreis von Interesse mit einem Durchmesser von 100 Einheiten (Analyze / Tools / ROI-Manager / Mehr / angeben). Duplizieren Sie diesen Kreis (ROI Manager / Add) zu acht Kreise insgesamt zu schaffen. Bewegen Kreise 1-5, fünf Regionen, die gleichmäßig elektroporiert auszuwählen, die Vermeidung der äußeren Ränder der Netzhaut und dem Gebiet über der Linse (Abb. 4A). Wählen Sie außerdem drei Regionen (Kreise 6-8) außerhalb der Netzhaut / Objektiv Hintergrundfluoreszenz zu messen. Wählen Sie das rote Bild, deaktivieren Sie das "Show all"-Box in ROI-Manager, und re-aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Alle acht Kreise sollten sich auf das rote Bild erscheinen. De-select all Kreis Koordinaten in ROI-Manager.
4. Mit dem roten Bild ausgewählt, werden die Mittelwerte Pixelwert für alle Kreise von Interesse (ROI Manager / Measure); Messungen 1-8 erscheinen soll, wo 1-5 Die rote Netzhaut Messungen und 6-8 sind die roten Hintergrund-Messungen. Wählen Sie das grüne Bild und notieren die mittlere Pixelwert; Messungen 9-16 erscheinen, wo 9-13 grünen Netzhaut Messungen und 14-16 sind die grünen Hintergrund Messungen. Kopieren Sie die Messdaten in Excel zur Analyse (Abb. 5).
5. Durchschnittliche die drei Hintergrund-Messungen in die rote und die grüne Kanäle. Subtrahieren Sie die roten Hintergrund Durchschnitt von jedem der fünf Netzhaut Messungen in den roten Kanal, wiederholen Sie für den grünen Kanal. Für jede Netzhaut Region-of-interest, teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert rot Messung durch die Hintergrund-subtrahiert grün Messung, um die experimentellen Rot-Pegel an die Steuerung grüne Ebene (Abb. 5) zu normalisieren.
6. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung aller normierten Messungen für eine gegebene DsRed Konstrukt (zB 5 Messungen pro Netzhaut mal 3 separate Netzhaut). Um quantitativen Vergleich der Ergebnisse der electroporations an verschiedenen Tagen durchgeführt, immer mit einem "Standard"-DsRed / GFP Niederschläge in jeder Elektroporation gesetzt. Relative Expression Werte über Experimente können durch die Normalisierung der Expression dieser verglichen werden "Standard".

10. Repräsentative Ergebnisse:

Eine gute Elektroporation zur Expression des DNA-Konstrukts (s) über 1 / 4 bis 1 / 3 der retinalen Oberfläche (Abb. 4A). Da Stäbchen-Photorezeptoren in allem effizient transduziert, ist diese Technik ideal für die Quantifizierung von Photorezeptor-spezifischen Promotoraktivität (Abb. 4B). Bislang hatten wir diesen Ansatz auf eine Reihe von Promotor-Varianten von der Stange-spezifische Rho und Gnat1 loci ¹⁰ quantifizieren. Wir fanden, dass es möglich ist, Promotoraktivität über einen fast 300-fache Bandbreite zu quantifizieren.

Abbildung 5 ist ein Beispiel für Datensatz aus einer Hand elektroporiert Netzhaut. In diesem Beispiel wurde der experimentelle Aufbau pNrl (1.1kb)-DsRed in den roten Kanal gemessen und die Kontrolle zu konstruieren pNrl (3.2kb)-GFP wurde in den grünen Kanal gemessen. Ein kompletter Datensatz für die pNrl (1.1kb)-DsRed konstruieren würde von 6-9 Netzhaut auf diese Weise gemessen bestehen, und die Standardabweichung würde auf der Grundlage aller "DsRed normiert auf GFP"-Werte berechnet werden. Wenn wir den Vergleich wurden die Expression von pNrl (1.1kb)-DsRed, um zum Beispiel pNrl (0.8kb)-DsRed, dann werden beide Konstrukte müsste mit der gleichen GFP-Steuerung (zB pNrl (3.2kb) elektroporiert werden - GFP) und zur gleichen Belichtungszeiten abgebildet. Es ist möglich, Pool-Daten an unterschiedlichen Tagen erhoben, wenn ein Standard-DsRed / GFP Elektroporation ist an jedem Tag durchgeführt (zB pNrl (3.2kb)-dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). Für jeden experimentellen konstruieren, würden die normierten DsRed Ebene im Anschluss an die normalisierten DsRed Ebene des "Standard" (pNrl (3.2kb)-dsRed) normiert werden.

Die Technik, die wir hier beschreiben, ist in erster Linie sinnvoll für die Quantifizierung der Aktivität von Photorezeptoren CREs ^10,13.Zelltyp-spezifische cis-regulatorische Aktivität kann auch in selteneren retinalen Zelltypen wie bipolare Zellen ¹⁴ quantifiziert werden, sondern dies in der Regel voraus, dass die Bereiche von Interesse quantifiziert werden in vertikalen Querschnitten, anstatt in Flatmount Präparate ausgewählt werden. Das gleiche gilt von Cres, welche die Expression Laufwerk in mehreren Zelltypen wie Photorezeptoren und bipolaren Zellen. Die experimentellen Verfahren sind ansonsten ähnlich.

Abbildung 1. Übersicht über die Netzhaut Explantation Elektroporation Verfahren. Zunächst ganze Augen sind aus postnatalen Tag 0 Maus Welpen isoliert, und die Netzhaut sind seziert (P1). Zweitens sind die Netzhaut in Kammern mit DNA und Elektroporation (P2) gefüllt ist. Drittens sind die Netzhaut auf Filter gebracht und kultiviert 8 Tage (P3). Viertens sind die retinalen Explantate fest montiert auf Dias und abgebildet. Fluoreszenzintensität mit ImageJ-Software (P4) gemessen. Fünftens sind die ImageJ Daten in eine Tabellenkalkulation verarbeitet werden, um den Unterschied in der Aktivität verschiedener Promotoren (P5) zu quantifizieren.

Abbildung 2. Bau der Elektroporation Gericht. A) Unveränderte MicroSlide Kammer von Harvard Apparatus, BTX-Modell 453 (Katalog # 45-0105). B) Ein Dremel Werkzeug wird verwendet, um den Griff aus einem Kunststoffrohr Rack geschnitten. Länge 0,8 cm, Höhe 0,6 cm, Breite 0,3 cm: Der Griff ist in rechteckige Abstandshalter mit den folgenden Dimensionen geschnitten. C) Die Abstandhalter aus Kunststoff sind in den MicroSlide Kammer in gleichen Abständen angebracht. Aquarium Dichtstoff in die Lücken zwischen den Abstandshaltern (nicht dargestellt) injiziert. D) Ein Metallstab wird über die Abstandhalter gelegt. E) Die Bar und die Abstandshalter sind auf den Objektträger mit Bindemittel Clips eingespannt, um alles an seinem Platz zu halten, wie das Dichtmittel trocknet über Nacht. F) Die Abstandhalter werden entfernt und die Vertiefungen werden getestet, um sicherzustellen, dass sie wasserdicht sind. G) Das fertige Bild passt in die Plastikschale mit den Metallstangen neben dem Fenster in der Seite der Schale.

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Elektroporation Gericht mit Netzhaut. Die Kammern sind mit DNA-Lösungen (bis zu fünf verschiedene Lösungen zu einem Zeitpunkt) gefüllt. Netzhaut sind in den Kammern und orientiert platziert, so dass die Linse gegen die Metallstange an der positiven Elektrode gelehnt; drei oder vier Netzhaut wird in jedem der fünf Kammern zu passen. Der elektrische Strom bewirkt, dass die negativ geladenen DNA-Moleküle in die Zellen der Netzhaut zu bewegen.

Abbildung 4. A) ImageJ Messung der retinalen Fluoreszenz Ebenen in Flatmount. Graustufen Flatmount Bilder in der DsRed (experimentell) und GFP (Kontrolle) Kanäle sind in ImageJ Software geöffnet; beachten Sie, dass diese Bilder lediglich zu illustrativen Zwecken wurden gefärbt. Fünf Messung Kreisen (1 bis 5) werden über gleichmäßig elektroporiert Regionen gelegt, die Vermeidung der Kanten und Objektiv (gestrichelte Linien). Drei Messung Kreisen (6 bis 8) werden außerhalb der Netzhaut zu Hintergrundfluoreszenz Ebenen bestimmen platziert. B) Schnittbilder eines elektroporiert Netzhaut Explantation bei hoher Leistung. Das Explantat wurde am postnatalen Tag 8, in 30% sucrose/1X PBS über Nacht bei 4 cryoprotected ° C, in OCT eingebettet fixiert und Kryo-Schnitt bei 12 &mgr;. Die fluoreszierenden Konstrukte pNrl (1.1kb)-DsRed und pNrl (3.2kb)-GFP sind in Sehzellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) ausgedrückt. INL, innere Körnerschicht; GCL, Ganglienzellschicht.

Abbildung 5. Verarbeitung von Fluoreszenz-Daten mit Excel. In Schritt 1 wird der mittlere Pixelwert für jede Messung Kreis in der Tabelle (Zellen B3-B12, F3-F5, H3-H5) kopiert. Messungen # 1-5 sind die DsRed Netzhaut Werte und # 6-8 sind die DsRed Hintergrund Werte; Messungen # 9-13 der GFP Netzhaut Werte und # 14-16 sind die GFP Hintergrund Werte. Beachten Sie, dass die Messung Nr. 1 und Nr. 9 auf die gleiche Messung Kreis entsprechen, ebenso wie Messungen # 2 und # 10, und so weiter. In Schritt 2 wird der durchschnittliche Wert für den Hintergrund DsRed und GFP-Kanäle berechnet (Zellen F6, H6). In Schritt 3 die durchschnittliche Hintergrund ist von jeder Retina subtrahiert (Zellen C3-C12). In Schritt 4, die jeweils background-subtrahiert DsRed Messung zum entsprechenden GFP-Messung (Zellen D3-D7) normiert ist.