Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.
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Methodenartikel
Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wildvögel haben in der Ausbreitung der hoch pathogenen aviären Influenza (HPAI) des Subtyps H5N1 in Verbindung gebracht, woraufhin die Überwachung an den Flugrouten. Probenahme von Wildvögeln auf Geflügelpest-Virus (AIV) wird oft in abgelegenen Regionen durchgeführt, aber die Ergebnisse sind oft wegen der Notwendigkeit, Proben an ein Labor für molekulare Tests ausgestattet Transport verzögert. Real-time-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RRT-PCR) ist eine molekulare Verfahren, das eine der genauesten und empfindlichsten Methoden für die Diagnose von AIV bietet. Die bisher strengen Labor-Protokolle für rRT-PCR benötigt werden derzeit für den Bereich angepasst. Entwicklung von gefriergetrockneten (lyophilisierten) Reagenzien, die keine Kühlkette, mit Sensibilität auf der Ebene der nassen Reagenzien gebracht hat Vor-Ort-Remote-Tests, um ein praktisches Ziel.
Hier präsentieren wir eine Methode zur schnellen Diagnose von AIV bei Wildvögeln mit einem rRT-PCR-Einheit (Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device oder RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), dass lyophilisierte Reagenzien beschäftigt (Influenza A Target 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). Die Reagenzien enthalten alle erforderlichen Komponenten für die Prüfung bei entsprechenden Konzentrationen in einem einzigen Rohr: Primer, Sonden, Enzyme, Puffer und interne positive Kontrolle, Beseitigung von Fehlern mit unsachgemäße Handhabung oder Lagerung von nassen Reagenzien verbunden. Das tragbare Gerät führt einen Bildschirm für die Influenza A, indem sie auf der Matrix-Gen und liefert Ergebnisse innerhalb von 2-3 Stunden. Genetische Subtypisierung ist auch mit H5-und H7-Primer möglichen Mengen, die auf das Hämagglutinin-Gen.
Geeignet ist das System für den Einsatz auf Kloake und oropharyngealen Proben von Wildvögeln, wie hier auf dem wandernden shorebird Arten nachgewiesen, die westliche Flussuferläufer (Calidrus mauri) in Nordkalifornien aufgenommen. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Der primäre Vorteil dieser Technik ist die Diagnose von Wildvögeln zu beschleunigen, die Erhöhung der Chancen der mit einem Ausbruch in einem Remote-Standort. On-site-Diagnose wäre auch nützlich für die Bestimmung und Analyse von infizierten Personen in Wildpopulationen. Die Möglichkeit, Informationen über die Host-Biologie (immunologische und physiologische Reaktion auf eine Infektion) und räumlicher Ökologie (wandernde Leistung von infizierten Vögeln) sammeln Einblicke in welchem Maße Wildvögel können als Vektoren für AIV über lange Distanzen zu fungieren.
Protokoll
1. Wild Bird Capture mit Fangnetze
- Für shorebird erfassen, richten Fangnetze auf eine aktive Nahrungssuche Website wie ein Sumpf, Ufer, oder Schlamm flach.
- Slide Spiegelnetzen Leitungsschleifen von einem Ende des Nebels net um die Stange und legen Pol senkrecht in den Schlamm.
- Streck net, legen zweite Pole durch Spiegelnetzen Schlaufen am anderen Ende der Nebel net und vertikal einfügen Pol in den Schlamm, um sicherzustellen, dass die Spiegel-Linien gelehrt werden.
- Sobald ein Vogel gefangen, extrahieren Sie die Vögel aus dem Netz und Rückkehr zu den Streifen entfernt.
2. Kloakenabstriches Probe....
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Diskussion
Die Methode der schnellen Diagnose hier vorgestellten erleichtert zeiteffizient und genaue Prüfung von Wildvögeln Proben für die Überwachung von AIV. Die viel weniger strenge Probe Storage-Anforderungen von tragbaren rRT-PCR eignen sich für Situationen, in denen Remote-Wartung einer Kühlkette unpraktisch sein kann, wenn flüssigem Stickstoff Verlader oder Trockeneis ist nicht verfügbar. Darüber hinaus fanden wir, dass die Probenanalyse mit gefriergetrockneten Reagenzien war einfach genug, um von Feldbiologen mit minimale.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten M. Scullion und R. Crisp of Idaho Technologies für den technischen Support und der USGS westlichen Ecological Research Center für die Finanzierung (S. Schwarzbach) und Hilfe (K. Spragens, T. Graham) zu danken. Institut für Verteidigung und Homeland Security (www.idhs.org), zur Unterstützung des Department of Defense und Air Force Research Laboratory - Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des Zentrums für Innovative Technology durchgeführt. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| RNeasy Mini spin column | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| Sammelröhrchen (1,5 und 2 ml) | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| RNase-freies Wasser | Qiagen | 74106 | Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit |
| 14,3 Mio. β-Mercaptoethanol-Lösung | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120 V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolyse Probe) | Idaho Technologies | Asay-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml Kapillarrohre | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-Zentrifuge mit Rotor für 2 ml-Tuben | Idaho Technologies | Eingeschlossen in RAPID-Kit | |
| Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Eingeschlossen in RAPID-Kit | |
| Pentium-basierten Laptop mit Windows XP Professional | Idaho Technologies | Eingeschlossen in RAPID-Kit | |
| Lightcycler Data Analysis Software | Idaho Technologies | Eingeschlossen in RAPID-Kit |
Referenzen
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
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Nachdrucke und Genehmigungen
