ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Zusammenfassung

Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine ​​in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.

Zusammenfassung

Fluoreszierende Proteine ​​und Farbstoffe sind wesentliche Instrumente für die Untersuchung von Protein Menschenhandel, Lokalisation und Funktion in Zellen. Während fluoreszierende Proteine, wie zB grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden intensiv als Fusionspartner an Proteine ​​verwendet werden, um die Eigenschaften eines Proteins von Interesse ^1, die jüngsten Entwicklungen bei kleineren Tags ermöglichen neue Funktionalitäten von Proteinen in Zellen wie Konformationsänderung untersucht werden track und Protein-Vereins ^{2, 3.} Ein kleiner Tag-System beinhaltet eine Tetracysteinmotiv Motiv (CCXXCC) genetisch in ein Zielprotein, das biarsenical Farbstoffe bindet eingefügt, ReAsH (rote Fluoreszenz) und Flash (grün fluoreszierend), mit hoher Spezifität auch in lebenden Zellen ^2. Die TC / biarsenical Farbstoff-System bietet weit weniger sterische Einschränkungen an den Host-Protein als fluoreszierende Proteine, die mehrere neue Ansätze ermöglicht hat, Konformationsänderung und Protein-Protein-Interaktionen ^4-7 messen. Wir haben vor kurzem eine neuartige Anwendung des TC tags als Sensoren der Oligomerisierung in Zellen, die mutierte Huntingtin, die, wenn mutierte Aggregate in Neuronen in Huntington-Krankheit ^7. Huntingtin wurde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, einer ein fluoreszierendes Protein zu Protein Ort zu verfolgen und die zweite ein TC-Tag, das bindet nur biarsenical Farbstoffe in Monomeren getaggt. Daher aktiviert Veränderungen in Kolokalisation zwischen Protein und biarsenical Farbstoff Reaktivität submikroskopischen Oligomergehalt räumlich innerhalb von Zellen abgebildet werden. Hier beschreiben wir, wie TC-markierte Proteine ​​fusioniert an ein fluoreszierendes Protein (Cherry, GFP oder GFP) mit Flash oder ReAsH in Live Säugetierzellen und wie die beiden Farben-Fluoreszenz (Cherry / Flash, CFP / Flash oder GFP / quantifizieren Label ReAsH Kombinationen).

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung mit ReAsH / Flash

1. Mit Standard-Zellkultur-Methoden für Ihre Zelllinie von Interesse, bereiten eine Kultur von adhärenten Zellen direkt in einem Live Cell Imaging Rutsche bereit für die Transfektion.
2. Transfizieren Ihre Plasmid TC-markierten Gen von Interesse nach Ihren Transfektion Methode der Wahl.

Hinweis Es ist wichtig, um positive und negative Kontrollen nutzen, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an den TC tags zu bewerten und für Übersprechen der Fluoreszenz zwischen den Kanälen zu beurteilen, wenn das Sammeln konfokalen Aufnahmen. Daher ist für zwei Farbe....

Diskussion

Der Ansatz zur Kennzeichnung Proteinlokalisierung mit einem fluoreszierenden Protein und konformativen Eigenschaften mit einem zweiten Farbstoff bietet viel Potenzial für die Zuordnung, wo verschiedene Konformationen von Proteinen in Zellen und Ereignisse, die die Dynamik der Protein-Konformation ändern anfallen. ReAsH / Flash wurde zuerst als in-cell-Sensor für die Proteinfaltung von Säugetieren zelluläre Retinsäure-bindende Protein I ⁴ verwendet. In diesem Beispiel, das Flash gebunden an ein TC-Tag in zellu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagens	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
8-Well-μ-Slides	Ibidi	80826	Wir finden diese Kammer-Objektträgern sich als besonders nützlich zur Kultivierung von Zellen für die Bildgebung.
TC-Flash II In-cell Tetracysteinmotiv Tag Detection Kit * grüne Fluoreszenz * * für Live-Cell-Imaging	Invitrogen	T34561 (Flash) oder T34562 (ReAsH)
Hanks 'Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-103
2,3-Dimercapto-1-propanol	Sigma-Aldrich	D1129-5ML
1,2-Ethandithiol	Sigma-Aldrich	02390-25ML