Biochemische Measurement of Neonatal Hypoxie

Summary

Eine Methode ist beschrieben, biochemischer Marker des Neugeborenen Hypoxie-Ischämie zu messen. Der Ansatz nutzt Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC / MS).

Abstract

Neonatal Hypoxie Ischämie durch unzureichende Durchblutung eines Gewebes oder eines systemischen Mangel an Sauerstoff aus. Diese Bedingung gilt als Ursache / verschärfen gut dokumentiert neonatalen Erkrankungen einschließlich neurologische Beeinträchtigung ^1-3. Verminderte Adenosintriphosphat Produktion entsteht durch einen Mangel an oxidative Phosphorylierung. Zum Ausgleich für diese Energie entzogen Zustand Molekülen mit hoher Energie Phosphatbindungen abgebaut werden ^2. Dies führt zu erhöhten Werten von Adenosin, die später abgebaut zu Inosin, Hypoxanthin, Xanthin ist, und schließlich zu Harnsäure. Die beiden letzten Schritte in diesem Abbauprozess durch Xanthin-Oxidoreduktase durchgeführt. Dieses Enzym existiert in Form von Xanthin-Dehydrogenase unter normoxischen Bedingungen ist aber auf Xanthinoxidase (XO) unter Hypoxie-Reperfusion Umständen ^{4, 5} umgewandelt. Im Gegensatz zu Xanthin-Dehydrogenase, generiert XO Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt der Purin-Abbau ^{4, 6.} Das Wasserstoffperoxid in Kombination mit anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei Hypoxie produziert, oxidiert Harnsäure zu Allantoin Form und reagiert mit Lipidmembranen zu Malondialdehyd (MDA) ^7-9 zu generieren. Die meisten Säugetiere, Menschen befreit, besitzen das Enzym Uricase, die wandelt Harnsäure zu Allantoin. Beim Menschen kann jedoch nur durch Allantoin ROS-vermittelte Oxidation von Harnsäure gebildet werden. Aus diesem Grund ist Allantoin als Marker für oxidativen Stress in den Menschen, aber nicht in der Säugetiere, die Uricase haben.

Wir beschreiben Methoden unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) auf biochemischer Marker des Neugeborenen Hypoxie Ischämie zu messen. Menschliches Blut für die meisten Tests verwendet wird. Tierisches Blut, kann auch verwendet werden bei gleichzeitiger Anerkennung des Potenzials für Uricase-generated Allantoin werden. Purin-Metaboliten wurden die Hypoxie so früh wie 1963 und die Zuverlässigkeit von Hypoxanthin, Xanthin verbunden und Harnsäure als biochemische Indikatoren der neonatalen Hypoxie wurde von mehreren Forschern ^10-13 validiert. Die HPLC-Methode zur Quantifizierung von Purin-Verbindungen eingesetzt ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar. Die GC / MS-Methode zur Quantifizierung von Allantoin, ein relativ neuer Marker für oxidativen Stress verwendet, wurde von Gruber et al ⁷ angepasst. Diese Methode vermeidet bestimmte Artefakte und erfordert einen geringen Volumina der Probe. Methoden zur Synthese von MMDA verwendet wurden an anderer Stelle ^14, beschrieben ^15. GC / MS Quantifizierung von MDA wurde von Paroni et al angepasst. und Cighetti et al. ^{16, 17.} Xanthinoxidase-Aktivität wurde durch HPLC durch Quantifizierung der Umwandlung von Pterin zu Isoxanthopterin ¹⁸ gemessen. Dieser Ansatz erwies sich als ausreichend empfindlich und reproduzierbar.

Protocol

1. Probengewinnung und Verarbeitung

1. Sammeln Blutprobe in einem 6ml K3E EDTA K3 Rohr, das auf Eis gehalten wird.
2. Innerhalb von 2 min für die Sammlung, Zentrifuge die Probe bei 4 ° C bei 1500 g für 10 min.
3. Übertragen Sie den Überstand (Plasma), eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Zentrifuge bei 4 ° C mit 18000 g für 30 min.
5. Entfernen Sie den Überstand aliquotiert und übertragen sie in separaten Reaktionsgefäßen für den Purin (200 ul), Allantoin (50 ul), MDA (100 &mgr; l) und XO (120μl) Analyse. Achten Sie darauf, die Proben mit roten Blutkörperchen zu verunreinigen. Möglicherweise müssen Sie das Volumen des Plasmas f....

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden erlauben die Beurteilung des Neugeborenen-Hypoxie Ischämie. Dieses Protokoll verbindet die Messungen von Markern von Energie (ATP) Deprivation, oxidativer Stress, oxidative Schäden und Enzymaktivität zu einer umfassenden biochemischen Bild von der Gegenwart oder auch der Grad der hypoxischen Ischämie zu gewinnen. Trotz der Nützlichkeit dieser Methode gibt es potenzielle Einschränkungen. Erstens dauert es etwa 1-2 ml Blut, um genügend Plasma zu sammeln, um alle Tests auszuführen. Dies wird.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
6ml K3E EDTA K3 Rohr	Fisher Scientific	2204061
5702R-Zentrifuge	Fisher Scientific	05413319	Mit 13 und 16 mm Adapter
1.5ml Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5599
2-Amino	Sigma-Aldrich	A3509
Varian Cary 100 Spektralphotometer	Agilant Technologies	0010071500
Savant SpeedVac	Thermo Scientific	SC210A-115
Micron Zentrifugalfilter Gerät	Fisher Scientific	UFC501596
Supelcosil LC-18-S Column	Sigma-Aldrich	58931
Supelcosil LC-18-S Supelguard Patrone und Halter	Sigma-Aldrich	59629
HPLC	Waters
GCMS Vial	Fisher Scientific	03376607
DL-Allantoin-5 -13 C; 1 -15 N	EUR Isotopes	M-2307	Lot # L340P9
MTBSTFA	Thermo Scientific	48920
Pyridin	Sigma-Aldrich	270970
5973E GC / MSD	Agilent Technologies	G7021A	Part # für 5975E GC / MS
3-Ethoxymethacrolein	Sigma-Aldrich	232548
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881
Dichlormethan	Sigma-Aldrich	270997
Benzol	Sigma-Aldrich	401765
Diisopropylether	Sigma-Aldrich	38270
BHT	Sigma-Aldrich	B1378
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Phenylhydrazin	Sigma-Aldrich	P26252