Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung In vivo.

Zusammenfassung

Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltung basiert auf präzisen Projektion Riechzelle (OSN) Axone ihre synaptischen Ziele im Riechkolben (OB). Die molekularen Mechanismen der OSN Axonwachstum und Targeting sind nicht gut verstanden. Manipulation der Genexpression und die anschließende Visualisierung der einzelnen OSN Axone und deren Terminal Laube Morphologie haben bislang eine Herausforderung. Zur Untersuchung der Genfunktion in der einzelnen Zelle Ebene innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens, entwickelten wir eine lentivirale basierende Technik, um die Genexpression in OSNs in vivo zu manipulieren. Lentivirale Partikel werden OSNs durch Mikroinjektion in die olfaktorischen Epithels (OE) geliefert. Expressionskassetten sind dann permanent in das Genom der transduzierten OSNs integriert. Das grün fluoreszierende Protein-Expression identifiziert infiziert OSNs und skizziert ihre gesamte Morphologie, einschließlich der Axonterminal Laube. Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Mikroinjektion und Reporter-Erkennung kann Genfunktion Studien in einem sehr engen Zeitraum der Entwicklung konzentrieren. Mit dieser Methode haben wir die GFP-Expression innerhalb von nur 3 Tage erkannt und so lange wie 3 Monate nach der Injektion. Wir haben sowohl Überexpression und shRNA vermittelten knock-down von lentiviralen Mikroinjektion erreicht. Diese Methode liefert detaillierte Morphologien der OSN Zellkörper und Axone an der einzelnen Zelle Ebene in vivo, und ermöglicht damit die Charakterisierung der Kandidaten-Gen-Funktion während olfaktorischen Entwicklung.

Protokoll

1. Vorbereitung

Dieses Verfahren ist Sicherheitsstufe 2, also all die folgenden Vorbereitungen sind in einem biohazard Haube, wo die Mikroinjektion Verfahren durchgeführt hat.

1. Vorbereitung und Vorwärmung einem 37 ° C Wasserbett: Füllen Sie eine Plastik Aufbewahrungstasche mit Wasser - Dichtung und auf eine entleerte Heizblock Inkubator. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen.
2. Füllen Sie ein biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf eine angemessene Lautstärke zum Eintauchen des gesamten Abfalls aus diesem Verfahren.
3. Bereiten Sie eine kleine offene Schale mit 70% Ethanol und eine zw....

Diskussion

Mikroinjektion von Lentivirus führt zu einer dauerhaften Übertragung von Gen-Konstrukten in OSN genomischer DNA. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, kurzfristige oder langfristige Manipulationen von Kandidatengenen über Überexpression oder shRNA vermittelten knock-down durchzuführen. Darüber hinaus können wir Fluoreszenz-Label einzigen OSNs in eine vorhandene transgene Maus Linie Co-Lokalisation von Geruchsrezeptoren Populationen zu beobachten. Mikroinjektion ist für lentivirale Transduktion OSNs erforderlich. Wir haben ve.......

Materialien

Mikroinjektion: Neugeborene Mäuse wurden mikroinjiziert mit einem 5μL Hamilton-Spritze (Hamilton # 7647-01) mit einer 33-Gauge-Nadel (Hamilton # 7762-06) ausgestattet.

Immunocytochemistry Reagenzien: Primärantikörper: polyklonalen Kaninchen-Antikörper GFP (Molecular Probes # A-6455), Huhn polyklonalen Antikörper gegen OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Meerschweinchen polyklonalen Antikörpers gegen VGLUT2 (Millipore # AB2251). Sekundärantikörper: Cy2-konjugierten Esel-anti-Kaninchen (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-konjugierten Esel-anti-Huhn (Jackson Immunolab # 703-165-155) und Cy5-konjugierten Ziege anti-Meerschweinchen (Jackson Immunolab # 106-175-008). Die Schnitte wurden auf Glasplättchen mit Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) mit 50ng/mL DAPI Chromatin Färbelösung montiert.

Konfokale Bildgebung: Z-Stapel-Aufnahmen wurden mit einer Olympus Flouview FV1000 konfokalen Mikroskop und Bilder gesammelt und in 3D-Projektionen mit Olympus FV10-ASW 2,01 konfokale Erfassung und Analyse-Software verarbeitet.