Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung In vivo.

Zusammenfassung

Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltung basiert auf präzisen Projektion Riechzelle (OSN) Axone ihre synaptischen Ziele im Riechkolben (OB). Die molekularen Mechanismen der OSN Axonwachstum und Targeting sind nicht gut verstanden. Manipulation der Genexpression und die anschließende Visualisierung der einzelnen OSN Axone und deren Terminal Laube Morphologie haben bislang eine Herausforderung. Zur Untersuchung der Genfunktion in der einzelnen Zelle Ebene innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens, entwickelten wir eine lentivirale basierende Technik, um die Genexpression in OSNs in vivo zu manipulieren. Lentivirale Partikel werden OSNs durch Mikroinjektion in die olfaktorischen Epithels (OE) geliefert. Expressionskassetten sind dann permanent in das Genom der transduzierten OSNs integriert. Das grün fluoreszierende Protein-Expression identifiziert infiziert OSNs und skizziert ihre gesamte Morphologie, einschließlich der Axonterminal Laube. Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Mikroinjektion und Reporter-Erkennung kann Genfunktion Studien in einem sehr engen Zeitraum der Entwicklung konzentrieren. Mit dieser Methode haben wir die GFP-Expression innerhalb von nur 3 Tage erkannt und so lange wie 3 Monate nach der Injektion. Wir haben sowohl Überexpression und shRNA vermittelten knock-down von lentiviralen Mikroinjektion erreicht. Diese Methode liefert detaillierte Morphologien der OSN Zellkörper und Axone an der einzelnen Zelle Ebene in vivo, und ermöglicht damit die Charakterisierung der Kandidaten-Gen-Funktion während olfaktorischen Entwicklung.

Protokoll

1. Vorbereitung

Dieses Verfahren ist Sicherheitsstufe 2, also all die folgenden Vorbereitungen sind in einem biohazard Haube, wo die Mikroinjektion Verfahren durchgeführt hat.

1. Vorbereitung und Vorwärmung einem 37 ° C Wasserbett: Füllen Sie eine Plastik Aufbewahrungstasche mit Wasser - Dichtung und auf eine entleerte Heizblock Inkubator. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen.
2. Füllen Sie ein biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf eine angemessene Lautstärke zum Eintauchen des gesamten Abfalls aus diesem Verfahren.
3. Bereiten Sie eine kleine offene Schale mit 70% Ethanol und eine zweite Schüssel mit sterilisiert ddH2O Ort und in der biologischen Sicherheitswerkbank.
4. Sterilisieren ein 5μL Kapazität Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel durch Besprühen Sie den Körper und die Nadel mit 70% Ethanol mit dem Kolben herausgezogen all the way. Immer wieder absaugen Ethanol aus der Schale und werfen Sie sie den ganzen Weg aus mindestens 5-mal.
5. Spülen Sie die Spritze Patrone durch Absaugen und Auswerfen sterilem Wasser mindestens 5-mal. Legen Spritze sicher beiseite in die Kultur Kapuze und trocknen lassen.
6. Entfernen Sie Virus Aktien von -80 ° C Gefrierschrank Lagerung und auf Eis stellen können Auftauen. Mikroinjektion erfordert 2μL Virus-Bestand pro Maus bei einem Titer von 10 ⁹ infektiöse Einheiten / ml. Lentiviren können im Handel bezogen werden oder im Labor hergestellt nach dem etablierten Protokoll (Lois et al., 2002).
7. Bereiten Sie eine Injektion der Bühne, dass einem Bereich oberhalb der Motorhaube Oberfläche gehoben bietet - ein 10cm Kulturschale mit einem Blatt Kimwipe abgedeckt verwenden.
8. Vereinbaren Alkoholtupfern in der Nähe der Injektionsstelle entfernt.

2. Mikroinjektion von lentiviralen Partikeln in die olfaktorischen Epithel

Alle tierischen Verfahren in dieser Methode durchgeführt werden nach IACUC genehmigten Richtlinien durchgeführt. Das Mus musculus Stammes C57BL/6J ist im Tiermodell in allen Versuchen verwendet hier gezeigt.

1. Betäuben Maus Welpen durch Hypothermie, indem sie eine Maus pup (P0-P3) aus dem Käfig und setzen den Welpen auf einer aufgeschnittenen Handschuh auf Eis für 5 Minuten.
2. Während des Wartens auf den Welpen voll narkotisiert, absaugen 2μL von viralen Lager werden in der sterilisierten Hamilton-Spritze.
3. Platzieren Sie die Maus Welpe auf der Injektion der Bühne. Ziehen Haut weg von der Oberseite des Kopfes am Ohr in Richtung der Oberseite des Halses. Dies sollte ein gelehrt Hautoberfläche über die Nasenhöhle bieten und Injektion zu erleichtern.
4. Setzen Sie die Nadel durch den oberen Teil der Nasenhöhle ca. 3mm unter der Hautoberfläche auf die Riechschleimhaut erreichen. Microinject 0.5μL Virus-Lösung pro Schuss, der Wahl zwei Standorte pro Seite, links und rechts (vier Injektionen insgesamt pro Maus = 2μL des Virus erforderlich). Die Injektionsstelle sollte voneinander versetzt werden. Für die Ausrichtung der richtigen Injektionsstellen, Suche dorsalen Schädel Oberfläche für den Umriss der Riechkolben. Diese Linie ist kaum sichtbar bei der Geburt durch die semi-transluzente Haut und Schädel. Um zwei Injektionen pro Seite, Ziel einer Injektion nur rostral einer Lampe Umriß einer medialen Achse. Nehmen Sie die zweite Insertion lateral um die Birne skizzieren, aber achten Sie darauf, die Injektion medial, so dass Sie kann das olfaktorische Epithel, ventral liegt unterhalb der Lampe zu erreichen Winkel. Vermeiden Sie durchdringen den Riechkolben!
5. Trocken tupfen restliche Virus-Lösung oder Blut, das von der Injektionsstelle oder Nasenlöcher mit einem Kimwipe entweichen kann. Unmittelbar von Kimwipes verfügen in der verdünnten Lauge den geltenden Bestimmungen.
6. Legen Sie die injizierten Maus auf das Wasserbett Inkubator.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1-4 für alle Mäuse injiziert werden, erinnern Sie über 2μL Virus-Bestand pro Maus benötigen.
8. Lassen Mäuse auf dem Wasserbett Inkubator für 30 Minuten erholen, bevor sie wieder in ihre ursprüngliche Verschachtelung Käfig.
9. Entsorgen Sie die Mikroinjektion Bühne, desinfizierende Tücher und keine zusätzlichen Reinigungs-Papier-Produkte in der Lauge biohazard Verfügung.
10. Reinigen Sie die Hamilton-Spritze durch mehrmaliges Ansaugen und Ausstoßen von Ethanol und dann mit Wasser, wie in der vorbereitenden Schritte getan. Lassen Sie die Spritze, um zu trocknen.
11. Für maximale Transduktionseffizienz wiederholen Sie diesen Vorgang wieder in 4 Stunden. Infizierte OSNs kann über die gesamte Länge der Zelle sichtbar gemacht werden, in nur drei Tagen.

3. Immunhistochemie von schwimmenden Riechkolben Abschnitte

1. Sacrifice das injizierte Maus auf den gewünschten Zeitpunkt und Perfusion fix das Gewebe mit 4% Paraformaldehyd. Sezieren die OB. Inkubieren in Paraformaldehyd über Nacht und dann 30% Saccharose in PBS über Nacht. Embed in OCT Einbettmedium auf Trockeneis.
2. Koronare OB Abschnitte werden mit einer 60 um Dicke mit einem Kryostat erhalten. Sweep Glühbirne Abschnitte in einen 10cm Kulturschale mit 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Die Schnitte werden schwimmend gehalten in PBS, um OAT d ermöglichenissolve. Transfer schwimmenden Abschnitte und PBS in ein 50ml-Fläschchen konisch.
3. Lassen Abschnitte auf den Grund des Fläschchens zu begleichen. Absaugen PBS ohne Ansaugen alle Abschnitte. Spülen Sie Gewebeschnitte mit 20ml PBS. Wiederholen Sie absetzen und Staubsaugen Schritte. Resuspendieren Gewebe mit 10 ml PBS und Transfer schwimmenden Abschnitte, um eine 15 ml konische Röhrchen für Immunfärbung. Sobald Gewebeschnitten niedergelassen haben, absaugen PBS Überstand ohne störende Gewebe. Resuspendieren Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) ermöglicht Reinigungsmittel Zellmembranen zu perforieren. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und wiederholen Inkubation mit PBS-Tx zweimal.
4. Inkubieren Gewebeschnitte in 10 mL Blocking-Lösung (5% Pferdeserum in PBS-Tx) für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
5. Spülen Blockierungslösung mindestens zweimal mit PBS-Tx für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Bereiten Sie 2 ml eines primären Antikörper-Lösung in PBS-Tx. Siehe Reagenzien und Geräte Abschnitt für Antikörper in diesem Experiment verwendet.
7. Ersetzen zweite PBS-Tx blockiert abwaschen mit primärer Antikörper-Lösung. Inkubieren auf einem langsam Wippschüttler (~ 30rpm) bei 4 ° C für 24-48 Stunden, um gründliche Eindringen in den 60 um schwebende Abschnitte zu gewährleisten.
8. Nach der Inkubation kann der primäre Antikörper-Lösung abgerufen vorsichtig mit einer Pipette und Lagerung bei 4 ° C für die Wiederverwendung von bis zu zwei weitere Male innerhalb von zwei Wochen ohne nennenswerten Verlust an Intensität der Färbung.
9. Wash Schnitte dreimal in PBS-Tx für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Drehen (~ 30rpm).
10. Bereiten Sie 2 ml des sekundären Antikörper-Verdünnung in PBS-Tx. Saugen Sie die letzte Waschung und fügen sekundären Antikörper-Lösung auf Gewebeschnitten. Wickeln Sie das außerhalb der Färbung Fläschchen in Aluminiumfolie ein, um Licht, das Fluorophor Ausbleichen führen kann blockieren. Legen Sie wickelte Durchstechflasche auf einer langsam Wippschüttler und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht.
11. Discard sekundären Antikörper-Lösung durch Absaugen entfernt. Wash Abschnitte einmal mit PBS-Tx für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie zwei weitere Male mit PBS (pH 7,4) für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Montieren Sie die gefärbten Gewebeschnitten auf Glas-Objektträger mit Fluoromount G.
12. Bildschirm durch gefärbten Schnitten für positiv infizierten OSN Axone und Axon-Terminus mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.
13. Zur Konstruktion eine dreidimensionale Ansicht eines markierten OSN Axon und Terminal-Laube, machen eine Reihe von optischen Schnitten durch die 60 um Tiefe des Ziels OB Gewebeschnitt (entlang der z-Achse) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.
14. Dieser Stapel von Z-Abschnitt Bilder können anschließend gemeinsam projektiert werden, um eine 360 ​​° drehbaren Perspektive eines einzelnen markierten OSN Axon, einschließlich Terminal Laube Detail in allen ihren Teilen zu rekonstruieren. Jeder einzelne Drehwinkel erfasst und exportiert werden als Bilddatei (zB JPG, TIFF) für 2D-Format Präsentation.

4. Repräsentative Ergebnisse

Mit der hier beschriebenen Methoden können wir Riechzellen durch Lentivirus in vivo transduzieren. Wir haben bisher visualisiert infiziert OSNs mit GFP und mCherry fluoreszierenden Reporter, als auch mit einem myc-Tag-Fusionsprotein über Immunzytochemie. Diese Technik bietet eine Fülle von infizierten OSNs. Dennoch tritt Transduktion sporadisch genug, um individuell beschriftet OSNs bieten, so dass für die Analyse der einzelnen Zelle Morphologie. Axone und Axon-Terminals sind in OB Gewebeschnitten inmitten ihrer natürlichen Umgebung durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) abgebildet. Die gesamte OSN Axonterminal Laube kann in der Regel innerhalb einer 40-50 um optischen Schnitt begeistert sein. Hohe Vergrößerung der infizierten OSN Axonterminalen ermöglicht eine detaillierte Analyse der axonalen Laube Morphologie an der glomerulären Schicht.

Abbildung 1. Flugbahn der einzelnen Riechzelle Axon und seinen Anschluss Laube. A) A Frontalschnitt der Riechkolben einer P7-Maus, die den olfaktorischen Nerv Schicht (ONL) immungefärbt für OMP (rot) und der glomerulären Schicht (GL) immungefärbt sowohl mit OMP und VGLUT2 (grau). Ein einziger Riechzelle Axon, die GFP (grün) reist in den ONL und dringt in die glomeruläre Struktur. B) Die Axonterminal Laube Morphologie innerhalb der Glomerulus deutlich GFP-Expression hervorgehoben. VGLUT2 Co-Färbung in grau leuchtet die gesamte glomeruläre Bereich, in dem die GFP-positive Axon erarbeitet ein Terminal Abtreibung. C) Lentivirale infiziert OSNs, die GFP (grün) in der OE. Die cytostructure des olfaktorischen Epithels ist mit DAPI-Färbung (blau dargestellt). GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von OSN Zellkörper und ihre zelluläre Prozesse in der OE. D) Ein OSN Axon und seinen Anschluss Morphologie mit Rap1GAP2 Ausdruck knock-down von shRNA. Lentiviren tragen eine doppelte Expressionskassette mit Rap1GAP2 shRNA unter der Maus U6-Promotor und GFP unter einemCMV-Promotor wurden die OE angewendet. Infizierte olfaktorischen Axonterminalen zeigte einen vereinfachten Anschluss Laube, wenn der der GFP nur Kontrolle verglichen. Bar = 20 um.

Diskussion

Mikroinjektion von Lentivirus führt zu einer dauerhaften Übertragung von Gen-Konstrukten in OSN genomischer DNA. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, kurzfristige oder langfristige Manipulationen von Kandidatengenen über Überexpression oder shRNA vermittelten knock-down durchzuführen. Darüber hinaus können wir Fluoreszenz-Label einzigen OSNs in eine vorhandene transgene Maus Linie Co-Lokalisation von Geruchsrezeptoren Populationen zu beobachten. Mikroinjektion ist für lentivirale Transduktion OSNs erforderlich. Wir haben ve...

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