Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.
Methodenartikel
Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Untersuchungen zur Pathogenese des Typ 2 Diabetes und der Langerhans-Inseln Fehlfunktion 1 wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Typ 2 Diabetes Inselchen von Organspendern 2 wurde behindert. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus menschlichen Pankreasgewebe von Typ-2-Diabetikern und Nicht-Diabetikern, die partielle Pankreatektomie aufgrund unterschiedlicher Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse (gutartige oder bösartige Tumoren der Bauchspeicheldrüse, chronische Pankreatitis und Choledochus-oder Zwölffingerdarm-Tumoren) unterzogen haben gewonnen . Alle Patienten beteiligt gaben ihre Zustimmung zu dieser Studie, die auch von der lokalen Ethikkommission genehmigt worden waren. Die chirurgische Proben wurden sofort in die Pathologen, weich und wirkt gesund Pankreasgewebe für Insel Isolierung gewählt und behielt das geschädigte Gewebe zu diagnostischen Zwecken geliefert. Wir fanden, dass mehr als 1.000 Inseln zu isolieren, mussten wir mit mindestens 2 g Pankreasgewebe beginnen. Auch wichtig, um unser Protokoll war sichtlich dehnen das Gewebe bei der Injektion des Enzym-haltigen Medien und anschließend zerkleinern sie die Verdauung durch Vergrößerung der Oberfläche zu unterstützen.
Zur Verlängerung der Anwendbarkeit unserer Protokoll zum gelegentlichen Fall, in dem eine große Menge (> 15g) der menschlichen Pankreasgewebe ist verfügbar sind, verwendeten wir eine Ricordi Kammer (50 ml), um das Gewebe zu verdauen. Während der Verdauung, wir manuell schüttelte den Ricordi Kammer 3 mit einer Intensität, die von Probe nach seinem Niveau Gewebefibrose vielfältig. Eine diskontinuierliche Ficoll Gradient wurde dann verwendet, um die Inseln aus acinärem Gewebe zu trennen. Wir haben festgestellt, dass das Gewebe Pellet sollte klein genug sein, um homogen in Ficoll Medium mit einer Dichte von 1,125 g / ml resuspendiert. Nach der Isolierung wir die Inseln unter stressfreien Bedingungen (kein Schütteln oder Drehen) mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert für mindestens 48 h, um ihre funktionelle Wiederherstellung zu ermöglichen. Die weit verbreitete Anwendung von unserem Protokoll und seine Zukunft verbessern könnte damit die rechtzeitige Ernte von großen Mengen von menschlichen Inseln von diabetischen und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten, stark fortschreitenden Typ-2-Diabetes-Forschung.
Protokoll
1. Pankreasgewebe Sammlung im OP
- Der Chirurg führt eine Teilresektion des Pankreas.
- Nach dem Aufsetzen des Pankreas Probe in einem Kasten auf dem Eis, liefern sie sofort an den Pathologen.
2. Tissue Auswahl für Inselzellen isoliert
- Der Pathologe wählt Gewebe, das weich und gesund erscheint, halten das geschädigte Gewebe zu diagnostischen Zwecken. Fibrotische Gewebe und Proben mit weniger als 2 g verwertbarem Gewebematerial aus Inselzellen isoliert ausgeschlossen.
- Tauchen Sie das Pankreasgewebe in Euro Collins-Lösung und liefern auf Eis ins Labor.
3. Isolation von menschlichen Inseln
- Wiegen Sie das Pankreasgewebe, dann legen Sie sie in eine 10 cm Schüssel.
- Legen Sie 150 ml RPMI-Medium in einem 500 ml-Flasche.
- In einem 250 ml Kolben, bereiten Sie das Verdauungsenzym-Lösung durch die Kombination von 130 ml RPMI-Medium mit 100 mg / ml DNase und 20 ml 5mg/ml Liberase RI. Draw 10 ml dieser Lösung in eine Spritze mit dem Pankreasgewebe zu injizieren.
- Spritzen Sie das Verdauungsenzym-Lösung in das Pankreasgewebe mit dem Ziel, sie homogen zu dehnen. Wenn dies durch Fibrose verhindert ist, wird der Verdauungsprozess wahrscheinlich fehlschlagen. Als nächstes Blatt vor den Mund des Gewebes in ca. 4 mm 3 Stück auf Eis.
4. Menschlichen Pankreas Verdauung Schaltung
- Montieren Sie die Verdauung Schaltung wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Strömungsrichtung im Ricordi Kammer ist in an der Unterseite und bei der Spitze der Kammer.
- Fügen Sie die restlichen Verdauungsenzym Lösung für die 500 ml Flasche bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml und legen Sie ein Thermometer.
- Übertragen Sie die Pankreasgewebe in die Kammer, legen Sie die Maschen (Porendurchmesser: 600 pm) und drei Siliziumnitrid Marbles (Durchmesser: 15 mm), in der Nähe der Kammer und die Pumpe mit der Strömung bei 140 ml / min eingestellt.
- Wenn die Temperatur der Schaltung 37 ° C erreicht, Startzeitpunkt und in regelmäßigen Abständen Proben zu nehmen, um zu bestimmen, wenn die Verdauung zu stoppen. Die Färbung mit Dithizon (2 mg / ml) ermöglicht mikroskopische Visualisierung der Inseln innerhalb der verdauten Gewebe 4.
- Sobald die kleinen Inseln aus den umliegenden acinäres Gewebe getrennt sind, stoppen Sie schnell die Verdauung, indem sie die Heizspirale auf Eis und Zugabe von 200 ml kaltes Waschen Medien (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glukose und 10% FBS), um den Stromkreis.
- Sammeln Sie die Insel-Lösung in 250 ml konische Röhrchen, wie es kommt aus dem Probenröhrchen. Fahren Sie bis zur Schaltung ist leer.
Abbildung 1. Die menschliche Bauchspeicheldrüse Verdauung Schaltung der menschlichen Bauchspeicheldrüse Verdauung Schaltung umfasst einen Ricordi Kammer mit mesh (Porendurchmesser: 600 pm) und drei Siliziumnitrid Kugeln (Durchmesser: 15 mm). Mittelabfluss aus der Kammer ist es, das Gewebe Auffangkolben durch die Schlauchpumpe (140 ml / min) angetrieben. Die Pfeile zeigen die Fließrichtung. Eine optimale Temperatur für enzymatische Verdauung wird durch Eintauchen der Heizspirale in einem 37 ° C Wasserbad gehalten.
5. Washing post-Verdauung
- Zentrifugieren Sie die 250 ml konische Röhrchen mit der Insel-Lösung bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min.
- Überstand verwerfen, resuspendieren der Insel Pellet in Waschmedium (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glucose und 10% FBS) und verteilen sie in gleiche Anteile auf 50 ml konische Röhrchen. (Optional:. Verteilen in zusätzliche konische Röhrchen zu verbessern Waschen) bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min.
- Überstand verwerfen und sanft lösen Pellets durch manuelles Schütteln.
6. Reinigung über einen Ficoll-Gradienten
- Das Pellet mit Ficoll Medien mit einer Dichte von 1,125 g / ml, pH 7,4 und langsam Overlay 10 ml Aliquots von Ficoll Medien mit einer Dichte von 1.080, 1,060 und 1,037 g / ml.
- Zentrifugieren Sie die Ficoll Gradienten bei 2400 rpm, 4 ° C für 20 min.
7. Islet Sammlung und Kultur
- Nach der Zentrifugation können unterschiedliche Gewebe-Komponenten durch ihre Aufteilung in der Steigung unterscheiden.
- Entsorgen Sie die obere Schicht, bestehend aus Fett-und Bindegewebe.
- Sorgfältig Ernte die erste Schicht der Insel Aggregate an der 1,037-1,060 g / ml Interphase. Diese Schicht enthält die reinste isolierten Inseln. Sammeln Fraktionen getrennt für effiziente Isolierung.
- Sammeln Sie die zweite, weniger reine Fraktion von Inselzellen Aggregate an der 1,060-1,080 g / ml Interphase.
- Verdünnen Sie die Ficoll-Gradienten, indem waschen Medien (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glukose und 10% FBS) zu jedem konischen Rohr bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml. Zentrifuge bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min.
- Verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen. Seien Sie vorsichtig, wie das Pellet kann locker sein aufgrund der Ficoll-Gradienten.
- Waschen Sie die Pellets with waschen Medien (900ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glucose und 10% FBS) und zentrifugieren bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie mit Inselchen Kulturmedien
- Resuspendieren Inselchen in Kulturmedien und legen Sie sie in den Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 24-48 Stunden vor der weiteren Verarbeitung.
Ergebnisse
Unser Protokoll ergab einen Durchschnitt von ca. 500 Inseln pro Gramm Pankreasgewebe, obwohl diese sehr stark zwischen Präparate in erster Linie auf Unterschiede in der Fibrose und Kollagenase-Aktivität unterschiedlich. Wir erreichten> 90% Reinheit Insel durch erste Färbung mit Dithizon während Gewebe Verarbeitung, dann Handlese sie 24 Stunden nach der Isolierung. Zur Bestimmung der Qualität des gereinigten Inseln, testeten wir für 25 mM Glukose-stimulierte Insulinsekretion unter statischen Bedingungen für 2 Stunden. Wir fanden Insulinsekretion vergleichbar mit der von Inseln aus ECIT Insel Isolation und Transplantationszentren erhalten. Wie kleine Inseln aus teilweise Pankreatektomierten Bauchspeicheldrüsen isoliert sind nicht für die Insel-Transplantation, Prüfung der gesamten IEQ wurde nicht als ein kritischer Faktor sein soll.
Wichtig ist, aktiviert unsere Methode uns Inselchen für funktionelle Untersuchungen zu isolieren von 25 partiellen Pankreatektomierten zwischen 2005 und 2008 5. Diese Inseln wurden für die Glukose-stimulierte Insulinsekretion und spezifische Protein-Expression mittels Western Blot und Immunhistochemie analysiert. Inseln aus teilweise pancreatecomized Bauchspeicheldrüsen isoliert könnte auch genutzt werden, um Gen-und Proteinexpression Profile, ultrastrukturelle Erscheinungsbild und funktionellen Antworten von nicht-diabetischen und diabetischen Inseln zu vergleichen. Da es mehr Patienten partielle Pankreatektomie als es Organspender sind, könnte unser Protokoll erlauben genug Proben und Daten für zuverlässige statistische Analysen gesammelt werden.
Diskussion
Mit unserem Protokoll, kann das menschliche Inseln aus Pankreasgewebe von einer partiellen Pankreatektomie gesammelt isoliert werden. Der Erfolg dieses Protokoll stützt sich auf die Betreuung während ein paar kritische Punkte genommen. Zur Wahrung Beta-Zell-Lebensfähigkeit, ist es unerlässlich, dass die Probe schnell auf Eis ins Labor transportiert werden. Darüber hinaus muss die Dauer des Gewebes Verdauung empirisch nach dem Grad der Gewebe Fibrose und die enzymatische Aktivität der Medien optimiert werden. Dies gilt auch für den Grad der mechanischen Kraft manuell auf die Ricordi Kammer aufgetragen wahr. So eine gute Insel Ausbeute zu erhalten, ist das Protokoll am besten durch eine engagierte Wissenschaftler oder technische Assistentin durchgeführt. Initial Scheitern ist die Regel, es sei denn das Team ist bereits in Insel Isolation erlebt.
Es gibt wesentliche Unterschiede zwischen unseren kleinen Insel Isolation Protokoll und die Standard-menschlichen Inselzellen isoliert Methode: 1) Obwohl wir Pankreasgewebe unterzogen zu mehreren Stunden der Ischämie während des chirurgischen Eingriffs zu verwenden, ist es sofort vor Ort verarbeitet. Dies steht im Gegensatz zu Bauchspeicheldrüsen explantierten von hirntoten Spendern für Pankreas / Inseltransplantation, die ischämischen bleiben für mehrere Stunden während der Zuteilung und Lieferung der Insel absperrbar. 2) Wir spritzen Kollagenase direkt in das Pankreasgewebe, während das Standard-Protokoll ist es in den Pankreasgang ziehen lassen. 3) Wir trennen die Inseln mit einem diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten statt der Erhebung der Inseln aus einem kontinuierlichen Ficollgradienten mit einem COBE Cell-Prozessor.
In Fällen, in denen die chirurgische Probe ist zu fibrotischen oder knappen zur Isolierung einer ausreichenden Zahl von Inselchen, kann Gewebe noch durch Laser Capture Mikrodissektion (LCM) 10 abgerufen werden. Dies ermöglicht Genexpression Daten aus praktisch jeder Probe gewonnen werden, auch wenn die Insel Isolierung fehlschlägt oder die Ausbeute ist sehr gering. Leider hat LCM nicht produzieren lebende Zellen für funktionelle Studien und ihre Menge ist in der Regel nicht ausreichend für Proteomanalyse. So kann die Verwendung von LCM in parallel mit unseren Kollagenaseverdau Protokoll, um die Inseln Abrufen der effektivste Weg, um chirurgische Proben zu verarbeiten.
Beim Sammeln von Gewebe für Inselzellen isoliert von partiellen pancreatectomies, ist es wichtig, sorgfältig zu prüfen, die Krankengeschichte des Patienten und metabolischen Zustand. Ein teilweise Pankreatektomierten Patient konnte nach Typ 3c-Diabetes, dh Diabetes sekundäre Erkrankung der Bauchspeicheldrüse, die zu der Operation 6 beeinflusst werden. Unter den 43 teilnehmenden Patienten, die diese Operation in unserer Abteilung erfuhr im Jahr 2010, 32 Nicht-Diabetikern wurden, 5 wurden von Diabetes Typ 2 und 6 betroffen war 3c-Diabetes. Diese Daten stimmen mit früheren Studien zeigte auf gestörten Glukose-Stoffwechsel und Diabetes in ein beträchtlicher Anteil von Patienten mit Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis 6. Wir haben überlegt, Diabetes zu primären Ursprungs, wenn sie diagnostiziert wurde mindestens ein Jahr vor dem Beginn der Symptome führt zu Pankreasoperation 7. Die Konzentrationen von Antikörpern gegen Inselzellen Autoantigene sollte auch gemessen werden, um eine mögliche autoimmune Entstehung der Zuckerkrankheit 8 zu bewerten. Da ein Patient, Pankreatektomie nicht diagnostizierter Diabetes leiden konnte oder Glukose intolerant, sollten alle nicht-diabetischen Patienten eine orale Glukosetoleranztest vor der Pankreatektomie 9 angegeben werden.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir wollen unseren vielen Kollegen, die Hilfe, Ratschläge und kritischen Input in verschiedenen Phasen des Projekts bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde mit Mitteln des deutschen Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF), um das Deutsche Zentrum für Diabetes-Forschung (DZD, unterstützt http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) und des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen hat eine Finanzierung von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) für das Innovative Medicine Initiative unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115005.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name | Firma | Katalog-Nummer | |
| Ausstattung | |||
| 1 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 604181 | |
| 10 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 607180 | |
| 25 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) | Greiner Bio-One | 760180 | |
| 10 ml Spritze | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 | |
| 50 ml Spritze | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 | |
| 5 ml Spritze | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 | |
| 18 G 1,1 / 2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 | |
| 27 GX1 / 2 Nadel | Braun | 4658300 | |
| 27 GX3 / 4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 | |
| 3 cm Zellkulturschale 2x2 mm Raster | Nunc | 174926 | |
| 20 cm Tissue Kulturschale | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 | |
| 6 cm Easy Grip Petrischale | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 | |
| 150 ml Vorratsflasche | Corning Incorporated | 431175 | |
| 250 ml Erlenmeyerkolben | Schott Duran | 21 217 36 | |
| 500 ml Erlenmeyerkolben | Schott Duran | 21 217 44 | |
| 250 ml Schraubverschluss konischem Boden Zentrifugenröhrchen | Corning Incorporated | 430776 | |
| 50 ml Falcon konischen Rohr | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 | |
| 260 ml Easyflask Non-behandelten | Nunc | 156800 | |
| Millex GV Filtereinheit Duropore (0,22 um) | Millipore | SLGV033RB | |
| Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Durchmesser Membran, 0,22 um Porengröße, 45 mm Größe des Halses, 500 ml Volumen) | Corning Incorporated | 431118 | |
| Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 | |
| Schnelle PES Filtereinheit 0,2 &mgr; | Nalgene | 569-0020 | |
| Heizwendel | Biorep Technologies Inc | HC-02 | |
| Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 | |
| Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 | |
| Ricordi Kammer (Metallgewebe mit 600 pm Porendurchmesser) | Biorep Technologies Inc. | Modell 50-U-01, Serial 0503-001 | |
| Vorbereitung Stehen | Biorep Technologies Inc. | 50-PS-01 | |
| O-Ringe | Biorep Technologies Inc. | OR-50-U-01 | |
| Siliziumnitrid Marbles (15 mm Satz von 9) | Biorep Technologies Inc. | SN-01 | |
| Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0 x4, 0 mm | |
| Chirurgische Pinzette | Braun | BD168R | |
| Chirurgische Schere (Aesculap) | Braun | BC273R | |
| OLS 200 | Zuschuss | OLS 200 | |
| Reagenzien | |||
| Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 | |
| D (+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 | |
| Diphenylthiocarbazon (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 | |
| DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 | |
| Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 | |
| Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 | |
| Fetale Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| 2 - (4 - (2-Hydroxyethyl) - 1-Piperazinyl)-ethansulfons ‰ ure (HEPES) | Roth | 9105,3 | |
| NaOH, 5 M | klinische Apotheke, Krankenhaus | - | |
| Penicillin / Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 | |
| Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 | |
| Potassiumchlorid | Fluka | 60132 | |
| Potassiumdihydrogenphospate wasserfrei | JT Baker | 0241 | |
| Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 | |
| RPMI Medium 1640 [-] D-Glucose [+] L-Glutamin | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI Medium 1640 [+] L-Glutamin | PAA Laboratories | E15-840 | |
| Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Medien und Lösungen
Dithizonlösung
- 100 mg DTZ in 10 ml DMSO und verdünnen in 40 ml PBS
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um)
Enzymlösung
- 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 Medium (ohne Zusätze)
- 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 Medium (ohne Zusätze)
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um) und halten das Enzym auf Eis
Wash Medien (1000ml/5.5mM Glucose)
- Lösen Sie 100 ml FBS (Hitze inaktiviert)
- Add 450 ml RPMI 1640 (ohne Glukose)
- Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM Glukose)
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um)
Islet Kulturmedien (500ml / 5,5 mM Glucose)
- Lösen Sie 10 ml 1M HEPES (pH 7,4)
- 50 ml FBS
- 5 ml Penicillin / Streptomycin (100x)
- Add 2,75 ml 1 M Glucose-Lösung
- Add 432,25 ml RPMI 1640 (ohne Glukose)
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um)
Euro Collins-Lösung
- 4.083 g Kaliumhydrogenphosphat
- 70,0 g Glukose
- 2.237 g Kaliumchlorid
- 14,80 g Kalium Monohydrogenphosphat
- 1.680 g Natriumhydrogencarbonat
- 40 ml Elektrolyt-Lösung (E 154)
- pH-Wert 7,4
- Destilliertem Wasser bis zu 2000 ml
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um)
Ficoll-Stammlösung
- Add 1000 ml Euro Collins-Lösung bis 500 g Ficoll
- Add 8,94 g HEPES
- Über Nacht rühren, bis Ficoll ist gelöst
- pH-Wert 7,4
- Messen Sie die Dichte
Ficoll Gradienten
- Berechnen Sie die Höhe der FBS, Euro Collins-Lösung und Ficoll Stammlösung nach der Dichte
- Kombinieren Sie die 3-Lösungen und die Dichte mit einem Densitometer
- Add Euro Collins-Lösung oder Ficoll-Stammlösung, bis die Dichte eingestellt
- Sterilfilter die Lösung (0,22 um) und lagern bei 4 ° C
Referenzen
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- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed? Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).
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- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
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Nachdrucke und Genehmigungen
