In vivo murine Leberperfusion: Eine Methode zur Infusion der Nagetierleber mit Lösung über die Pfortader

Zusammenfassung

Quelle: Cabral, F., et al. Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus der Leberperfusion der Maus. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Leberperfusion von Mäusen durch die Pfortader unter Verwendung von Kollagenaselösung vor der Isolierung von Leberzellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung

1. Vorbereitung von Lösungen und Nährmedien
   1. Bereiten Sie alle Nährmedien und Puffer gemäß der Materialtabelle vor.
2. Vorbereitung der Instrumente
   1. Stellen Sie ein Wasserbad (>10 l) bei 42 °C, eine Schlauchpumpe mit variabler Drehzahl und Klemmen zum Halten von Kolben auf. Bereiten Sie eine gebogene Schere und Pinzette vor (Abbildung 1).
   2. Legen Sie auf oder neben dem Wasserbad ein Backblech (ca. 38 x 26 cm) mit einer Styroporunterlage (50 mL konischer Rost), die mit einer saugfähigen Unterlage überzogen ist, die in ein 20 x 20 cm großes Stück geschnitten ist (Abbildung 1).
   3. Lege ein Stück Kreppband (5–8 cm) in die Nähe. Legen Sie einen 20 cm langen Polyester-Nähfaden in die Nähe, der geschnitten und gebrauchsfertig ist. Besorgen Sie sich einen Kunststoffkatheter mit einer einziehbaren Nadel (7 mm x 19 mm, Abbildung 1).
3. Vorbereitung von Glaswaren
   1. Setzen Sie mit Klammern einen 1-Liter-Kolben in das Wasserbad ein, der 200 ml 1x PBS enthält, und stellen Sie ihn mit einem Stopfen ruhig, in dem zwei 1-ml-Pipetten in die Lösung gelangen. Der Gummikorken ist eingekerbt, um die Rezirkulation der Flüssigkeit in einem geschlossenen Kreislauf zu ermöglichen.
   2. Setzen Sie mit einer anderen Klemme einen 125-ml-Kolben mit 45 ml Puffer 2 zusammen mit einem Stopfen ein, der zwei 1-ml-Pipetten enthält, von denen sich eine in der Flüssigkeit in der Nähe des Bodens des Kolbens befindet und die andere über der Flüssigkeit verbleibt und Sauerstoff in den Kolben bläst.
      Anmerkung: An jeder Pipette in den Stopfen ist ein Schnellkupplungsadapter angebracht, mit dem der Schlauch leicht gewechselt werden kann. Der Sauerstoff fließt über die Pipette im Stopfen, die nicht in die Flüssigkeit eingetaucht ist, sanft in beide Kolben.
   3. Stellen Sie zwei sterile Kristallisationsschalen beiseite.

>2. Verfahren bei Tieren

1. Erwärmen Sie die PBS- und Buffer 2-Lösungen im Wasserbad auf 42 °C und zirkulieren Sie PBS für mindestens 20 mL/min in den Schläuchen in einem geschlossenen Kreislauf, um die Flüssigkeitsleitungen warm zu halten. Tauchen Sie überschüssige Schläuche in das Wasserbad, um sie so nahe wie möglich an 42 °C zu halten. Lassen Sie das männliche Ende des Schlauchs in den 1-Liter-Kolben mit PBS ab.
2. Legen Sie einen Wattebausch auf die saugfähige Unterlage und geben Sie mit einer Transferpipette etwa 2 ml 30% Isofluran (bestehend aus Polyethylenglykol 200, das die Verdampfungsrate von Isofluran verringert) auf den Wattebausch.
3. Nehmen Sie die Maus am Schwanz, legen Sie sie in eine der Kristallisationsschalen und drehen Sie die Schale dann schnell auf den Wattebausch, so dass die Maus einen kleinen Raum hat, in dem sie die Anästhesie inhalieren kann. Beobachten Sie die Atemfrequenz der Maus und stellen Sie sicher, dass die Maus effektiv unter Narkose steht.
   Anmerkung: Die Atemfrequenz sollte langsamer und tiefer sein, der Schwanz schlaff und die Pfoten nicht auf den Kneiftest unter Narkose reagieren; Weitere Informationen finden Sie in den IACUC-Richtlinien.
4. Während die Maus unter Narkose geht (dies dauert 1-2 Minuten), bereiten Sie den Zylinder einer 10-ml-Spritze vor, indem Sie den Kolben herausziehen und einen kleinen Wattebausch einführen. Geben Sie 1–2 ml 30%iges Isofluran mit einer Transferpipette in den Wattebausch im Zylinder und legen Sie den Zylinder mit dem offenen Ende nach unten auf einen Tisch, während Sie darauf warten, dass die Maus bewusstlos wird.
5. Nehmen Sie schnell die Kristallisationsschale ab, drehen Sie die Maus auf den Rücken und platzieren Sie den Spritzenzylinder über der Nase. Überprüfen Sie die Atemfrequenz, das Kneifen der Zehen und den schlaffen Schwanz. Alle Reaktionen auf das Einklemmen der Zehen und den schlaffen Schwanz deuten darauf hin, dass die Maus nicht vollständig unter Narkose steht. Halten Sie den Spritzenzylinder über die Schnauze, um die Bewusstlosigkeit aufrecht zu erhalten.
6. Legen Sie die Daumennägel durch die Pfoten der Maus, wobei Sie die Gliedmaßen in Rückenlage ausgestreckt halten. Befeuchten Sie den Bauch und den Brustkorb mit 70% Isopropanol oder Ethanol.
7. Hebe mit der geraden Pinzette in einer Hand die Haut in der Nähe des Bauchansatzes an. Schneiden Sie mit einer Schere in der anderen Hand die Zelthaut und das Bauchfell ab. Der Schnitt sollte horizontal oder quer über die Basis der Zelthaut erfolgen. Achten Sie darauf, alle Haut- und Bauchfellschichten zu durchtrennen, um Zugang zum Darm zu erhalten. Seitlich um den Bauch herum bis zum Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne eines der Organe einzukerlen.
8. Schneide den Hautlappen ab, indem du den unteren Brustkorb durchschneidest. Bewegen Sie den Darm mit der Rückseite der Pinzette nach rechts, um die Pfortader freizulegen.
   Anmerkung: Blutungen aus dem Tier sollten minimal sein; Das Tier sollte noch atmen und unter tiefer Narkose stehen.
9. Platzieren Sie die geschlossene, gekrümmte Pinzette unter der Pfortader zwischen der Leber und der Vena pancreaticoduodenalis superior (Pfeil in Abbildung 2).
10. Öffnen Sie die Pinzette, während Sie sich unter der Pfortader befinden. Fassen Sie den Faden und ziehen Sie ihn vorsichtig durch, so dass er mittig unter der Pfortader liegt. Binde einen Überhandknoten um die Pfortader, ohne ihn festzuziehen.
11. Legen Sie die gekrümmte Pinzette unter die Pfortader und ziehen Sie sie vorsichtig in Richtung des Schwanzes der Maus, um die Vene zu begradigen (Abbildung 3A).
12. Mit dem Katheter in der anderen Hand platzieren Sie die Abschrägung der Nadel mit der Vorderseite nach oben und parallel zum unteren Teil der Pfortader in der Nähe der Pinzette (Abbildung 3B).
13. Punktieren Sie die Vene vorsichtig mit der Nadel (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass sich die Fase der Nadel im Lumen der Vene befindet. Ziehen Sie die federbelastete Nadel zurück und schieben Sie den Polymerkatheter weiter durch die Vene, bis sich die Fase in der Nähe des venösen verzweigten Bereichs befindet. Dies geschieht in der Leber. Wenn der Katheter richtig platziert wird, ist ein Rückfluss von Blut sichtbar. (Abbildung 3D).
14. Ziehen Sie den Überhandknoten fest und ziehen Sie ihn am Katheter nach unten, um ihn zu stabilisieren. Drehen Sie sofort die Pumprate von 20 ml/min auf 4 ml/min herunter und schneiden Sie ein weiteres großes Blutgefäß für die Drainage ab. Schneiden Sie die Aorta abdominalis für optimale Ergebnisse.
15. Platzieren Sie das männliche Ende des Schlauchs am weiblichen Ende des Katheters (Abbildung 4A). Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Leitung befinden. Achten Sie darauf, dass der Katheter weder in die Leber noch aus der Vene geschoben wird. Die Platzierung des Fadens ist nicht unbedingt erforderlich, hilft jedoch, einen Rückfluss aus der Vene zu verhindern und den Katheter in der richtigen Position zu halten (Abbildung 4B, C).
16. Verwenden Sie Kreppband, um den Schlauch auf der Unterlage zu fixieren. Drücken Sie das abfließende Blutgefäß mit der geraden Pinzette zusammen, um die Leber einige Male aufzublasen und sicherzustellen, dass das gesamte Blut abgeflossen ist (Abbildung 4D).
    Anmerkung: Standard-Laborklebeband funktioniert möglicherweise nicht; Das Kreppband bleibt jedoch auch bei Nässe an der Unterlage haften.

>3. Leber-Perfusion

1. Während die Leber mit PBS gespült wird, messen Sie etwa 24 mg Kollagenase Typ IV ab und geben Sie es in den Kolben mit 45 ml Puffer 2 im Wasserbad. Achten Sie darauf, die Flüssigkeit im Kolben zu schwenken, so dass die Kollagenase vollständig aufgelöst ist, und setzen Sie den Kolben wieder in die Klemme ein, so dass der flüssigkeitsenthaltende Teil des Kolbens vollständig in das Wasser eingetaucht ist.
2. Beobachten Sie die Veränderung der Farbe der Leber, wenn sie mit PBS gespült wird. Wechseln Sie den Auslaufschlauch vom 1-Liter-Kolben zum 125-ml-Kolben. Lassen Sie keine Luftblasen in die Leber strömen.
3. Sobald der Perfusionspuffer die Leber erreicht, drücken Sie das abfließende Blutgefäß kurz fest, um einen gewissen Druck im Gefäß aufzubauen und diese Flüssigkeit alle Leberlappen füllen zu lassen. Achten Sie darauf, die Drainage nicht zu lange zu unterbrechen, da dies das dünne Bindegewebe um die Leber herum (Glisson-Kapsel) sprengen und die Durchblutung oder den Flüssigkeitsfluss im Kapillarbett der Leber zerstören kann.
4. Lassen Sie Puffer 2 mit Kollagenase durch die Leber perfundieren, bis alle 45 ml durch das Gewebe geflossen sind.
   Anmerkung: Wenn dies erfolgreich ist, sollte die Glisson-Kapsel vom Parenchym oder dem Lebergewebe getrennt werden und die Leber selbst sollte amorph erscheinen.
5. Geben Sie etwa 10 mL Puffer 1 in die andere Kristallisationsschale und platzieren Sie sie neben der Maus.
6. Entfernen Sie den Katheter und schalten Sie die Pumpe aus.
7. Schneide mit der geraden Pinzette und der Schere die Leber von der Maus ab. Wenn die Kollagenaseverdauung sehr effizient war, kann es notwendig sein, einen sauberen, sterilen Löffel zur Hand zu haben, um die Leber aus der Maus zu schöpfen und in Puffer 1 zu legen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Perfusionssuite. Die Kolben werden durch Klammern (nicht abgebildet) an Ort und Stelle gehalten; Der Schlauch mit der Flüssigkeit, der während des Eingriffs vom 1-Liter-Kolben gegen den 125-ml-Kolben ausgetauscht wird, wird durch die rote gestrichelte Linie dargestellt. Es ist zu beachten, dass die Sauerstoffzufuhr nicht direkt in die Lösun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 L Erlenmeyerkolben	Fisher Scientific	Nr. S63274
250 mL Erlenmeyerkolben	Fisher Scientific	Nr. S63271
Silikon-Schlauch	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: 96400-14	Dieser Schlauch verläuft von den Kolben durch die Pumpe zum T-Anschluss und dann zur 1,0-ml-Spritze, die mit dem Katheter verbunden ist.
Tygon-Rohre	Fisher Scientific	Nr. R3603	Wird als Adapter zwischen 96400-14 und Pipetten und T-Anschluss verwendet. Dieser kann auch für den Sauerstoffschlauch verwendet werden.
T-Verbinder	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: EW-06294-82
Schnelle Trennungen	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 6150-0010
Klemmklemmen	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 6165-0002
Masterflex L/S Pumpe mit variabler Drehzahl; Modell 7553-70	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: EW-07559-00	Periplastische Pumpe mit variabler Drehzahl
Pumpenkopf; Modell 7014-20	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: EW-07014-20
1,0 mL Pipetten mit Graduierung aus Glas	Fisher Scientific	Nr. 13-678
Gebogene, nicht gezahnte Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14069-12
Dumont Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11252-20
Gebogene Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 13009-12
10 mL Spritze	Fisher Scientific	Tel.: 03-377-23	Es wird nur ein Zylinder Spritze benötigt
Sterlisierter Löffel	Baumarkt
Wattebausch(e)	Baumarkt
Nähgarn aus Polyester	Baumarkt
Klebeband	Baumarkt
Reißzwecken	Baumarkt
Styropor-Pad	Konisches 50-ml-Gestell
Kekse/Backblech	Baumarkt
Saugfähige Unterlagen	Fisher Scientific	Tel.: 14-206-64
19 L Wasserbad	Fisher Scientific	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Abgeschirmter IV-Katheter 24 Gauge	Becton Dickinson	381412	Kunststoffkathetar mit einziehbarer Nadel
Kristallisierschalen 100x50	VWR	Tel.: 89000-290
Petrischalen aus Styropor	Sigma Aldrich	P5481-500EA
Konische 50 mL Röhrchen	Fisher Scientific	Tel.: 12-565-270
Messpipetten (5 mL)	Fisher Scientific	170355
Messpipetten (25 mL)	Fisher Scientific	170357
EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	Artikel-Nr.: 542000	100 μm Filter
EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	Artikel-Nr.: 542040	40 μm Filter
reagenzien
Name	Verbindung	Gramm (g/L)	Millimolar (mM)
Puffer 1; pH 7,4	NaCl	8,3	Nr. 142
	Kcl	0,5	6,7
	HEPES	2,4	10
	Bsa	Nr. 15	0,226
Puffer 2; pH 7,4	NaCl	3,9	66,74
	Kcl	0,5	6,71
	CaCl2	0,7	6,31
	HEPES	24	100
	Bsa	Nr. 15	0,226
	Phenolrot	0,01	0,03
PBS; pH 7,4	NaCl	8	Nr. 137
Kcl	0,2	2,7
Na2HPO4-7H2O	1,15	4.3
KH2PO4	0,2	1,4
ANDERE REAGENZIEN
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
Kollagenase Typ IV	Sigma Aldrich	Nr. C5138
Isofluran	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: ab144581

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg )