FFPE-Tumorgewebe-Makrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von spezifischem Tumorgewebe aus ungefärbten Proben

Zusammenfassung

Quelle: Sugimoto, K. et al. Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur manuellen Makrodissektion von Krebsgewebe aus ungefärbten Gewebeproben, um ein spezifisches Krebsgewebe zu erhalten. Der Gewebeschnitt kann weiterverarbeitet werden, um DNA für genomweite Studien zu Magen-Darm-Krebs zu erhalten.

Protokoll

>1. Scrapen der Folien

1. Bereiten Sie einen Aufschluss-/Lysepuffer mit 650 ml mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser, 100 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 ml Trishydrochlorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8 und 200 ml 10 % Natriumdodecylsulfat (SDS) vor (siehe Materialtabelle).
2. Füllen Sie ein 1,5-ml-Einwegröhrchen aus Polypropylen mit 80 μl Aufschluss-/Lysepuffer (siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie eine saubere Pipettenspitze in den Puffer.
4. Identifizieren Sie Krebsgewebe des Tumorbereichs, die für die Makrodissektion am besten geeignet sind, entsprechend dem entsprechenden H&E-gefärbten Schnitt.
5. Makrodissektion von Krebsgewebe basierend auf dem markierten H&E-gefärbten Schnitt.
   1. Nehmen Sie eine saubere Rasierklinge und kratzen Sie das Krebsgewebe vorsichtig vom Objektträger ab und versuchen Sie, es in einem Stück zu halten, damit es leichter zu verarbeiten ist.
   2. Nehmen Sie die Pipettenspitze aus einem Einwegröhrchen aus Polypropylen, das den Puffer enthält, und übertragen Sie damit das abgenutzte Gewebe in das Pufferfläschchen (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die nasse Spitze sollte das Gewebe anziehen, was den Transfer erleichtert.
6. Wiederholen Sie Schritt 1.5 mit den restlichen Folien.
7. Nachdem sich das gesamte Gewebe in der Einweg-Polypropylen-Tube befindet, stellen Sie mit der Spitze sicher, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und nicht an der Wand der Tube klebt.
8. Geben Sie 20 μl einer Subtilisin-verwandten Serinprotease in die Durchstechflasche und schnippen Sie vorsichtig zum Mischen (siehe Materialtabelle).
9. Stellen Sie das Fläschchen für mindestens 4 h oder über Nacht in einen 55 °C heißen Heizblock. Achten Sie darauf, dass Sie nach 2 h leicht vortexen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% Natriumdodecylsulfat (SDS)	Qualität Biologisch	351-032-721 EA
DEPC-behandeltes Wasser	Qualität Biologisch	Tel.: 351-068-131
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Corning	Artikel-Nr.: 46-034-CL
Trishydrochlorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8	Qualität Biologisch	Artikel-Nr.: 351-092-101
Proteinase K	Neuengland Biolabore	Nr. P8107S
Einweg-Tube aus Polypropylen (Eppendorf)	Eppendorf	24533495